论文部分内容阅读
目的探讨Orexin-A对海马神经细胞凋亡的影响及作用机制。观察在大鼠海马神经细胞中,Orexin-A结合其受体后,能够增加还是减少细胞凋亡,即对细胞起到损害作用还是保护作用。究竟是通过过OX1R/OX2R-Gq-PLCβ-1细胞信号通路还是OX1R/OX2R-Gq-PLCβ-4信号通路,激活细胞外信号调节激酶ERK1/2的磷酸化。方法1、海马神经细胞的培养取36只24h内出生的Wistar大鼠,消毒,断头,急性分离海马组织。剔脑膜和血管,剪碎,胰蛋白酶消化,终止消化,吹打,过滤,离心,种植。细胞计数。2、siRNA设计根据Genbank中报道的大鼠PLCβ-1、PLCβ-4的mRNA序列,设计针对PLCβ-1、PLCβ-4基因的siRNA模板序列。3、慢病毒转染取培养3天的神经细胞,机分为正常对照组(CON),空病毒组(LV-control-siRNA),siRNA1,siRNA2以及siRNA3组。待95%的神经细胞汇合时,分别加入LV-control-siRNA,LV-PLCβ-1-siRNAl,LV-PLCβ-1-siRNA2,LV-PLCβ-1-siRNA3;LV-control-siRNA,LV-PLCβ-4-siRNAl,LV-PLCβ-4-siRNA2,LV-PLCβ-4-siRNA3。转染倍数(MOI)为5。3天后,在倒置荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白表达。4、聚合酶链反应PCR检测PLCβ-1RNA、PLCβ-4RNA干扰效率检测各组PLCβ-1mRNA、PLCβ-4mRNA的表达,分别选择一种沉默效率最高的siRNA,进行后续的正式实验。提取总RNA,逆转录合成cDNA,去除基因组DNA,逆转录反应,聚合酶链反应PCR。5、Orexin-A干预慢病毒转染3天后,每组平均分成未加入Orexin-A组(n=6只)及加入Orexin-A(n=6只)两个亚组,共六个亚组。加入Orexin-A终浓度为100nmol/L。6、流式细胞技术检测神经细胞的凋亡率Orexin-A干预48h后,进行细胞凋亡率检测。7、Western Blot测定磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(p-ERK1/2)的表达取Orexin-A干预48h后的神经细胞,提取总蛋白,BCA试剂盒检测蛋白浓度。制备聚丙烯酞胺凝胶(SDS-PAGE),转膜,洗膜,封闭,洗膜,一抗孵育,洗膜,二抗孵育,洗膜,增强化学发光ECL,比较蛋白表达量。结果1、海马神经细胞的培养和转染:三组细胞的海马神经细胞纯度均>90%,三组细胞转染效率均>90%。2、rt-PCR显示:PLCβ-1、PLCβ-4的siRNAl,siRNA2和siRNA3均可达到抑制基因表达的标准。其中,PLCβ-1中的siRNAl、PLCβ-4中的siRNA3,其抑制基因表达效率最高,用这两个来进行后续实验中的转染。3、流式细胞术显示:空病毒组内加入Orexin-A亚组的海马神经细胞凋亡率明显低于未加Orexin-A亚组(P<0.001);PLCβ-1组内加入Orexin-A亚组的海马神经细胞凋亡率与未加Orexin-A亚组无明显统计学差异(P>0.05);PLCβ-4组加入Orexin-A亚组的海马神经细胞凋亡率低于未加Orexin-A亚组(P<0.01)。4、Western blot显示:空病毒组内加入Orexin-A亚组的ERK1/2的表达明显高于未加Orexin-A亚组(P<0.001);PLCβ-1组内加入Orexin-A亚组的ERK1/2的表达与未加Orexin-A亚组无明显差异(P>0.05);PLCβ-4组加入Orexin-A亚组的ERK1/2的表达明显高于未加Orexin-A组(P<0.001)。结论1、Orexin-A在100nmol/L浓度下能够减少海马神经细胞的凋亡,对海马神经细胞有一定的保护作用。2、Orexin-A能够显著激活海马神经细胞的ERK1/2的磷酸化。Orexin-A对海马神经细胞的作用主要依赖于OX1R/OX2R-Gq-PLCβ-1信号途径,而OX1R/OX2R-GqPLCβ-4信号途径不是主要途径。阻滞OX1R/OX2R-Gq-PLCβ-1信号途径,将影响Orexin-A在细胞内发挥作用。未来可以通过干预该信号途径,影响Orexin-A的作用,为失眠和发作性睡病等睡眠障及学习记忆损害提供新的治疗靶点。