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目的：为什么要研究高血压状态下冠状动脉平滑肌细胞(CASMCs)离子通道?其目的在于：(1)CASMCs电生理特性尚不清楚,研究报道的文献很少,尤其是关于高血压状态下CASMCs电生理改变的报告更少,其原因可能在于分离CASMCs有一定难度,特别是在高血压心脏上分离CASMCs更难(研究后才发现)；(2)高血压状态下阻力血管的管壁张力增加,心脏压力负荷增大,心肌细胞代偿性肥大,目前对机体如何维持冠状动脉舒张功能的机制尚不清楚,因此了解如何保持阻力血管的血流,保障心肌供血的代偿机制很有必要；(3)血管平滑肌细胞(VSMCs)的电生理特征存在共性,但不同靶器官供血调节也存在个性,因此不能把电生理共性简单推导用于冠状动脉循环的调节。鉴于此,有必要立题研究正常血压和高血压状态下CASMCs的电生理特性。方法：(1)本题选用自发性高血压大鼠(SHR)作为高血压模型,因为其发病过程接近临床高血压病的发病过程。分离大鼠冠状动脉后,采用三步酶消化法获得CASMCs,并经过鼠源α-肌动蛋白单克隆抗体加以鉴定。(2)VSMCs的收缩依赖于钙离子内流,舒张依赖于钾离子外流。目前已知VSMCs膜表面存在四种钾离子通道,分别为钙激活电压依赖性钾离子通道(Kca)、电压依赖性钾离子通道(Kv)、内向整流性钾离子通道(Kir)以及ATP敏感性钾离子通道(KATP)。对于CASMCs膜表面存在的大电导钙激活电压依赖性钾离子通道(BKCa)本实验室先前也进行过研究。本课题主要研究CASMCs膜表面Kv通道电流以及Kv1.2和Kv1.5通道亚型mRNA和蛋白质的表达。(3)获得大鼠冠状动脉平滑肌细胞后,应用膜片钳全细胞记录模式分别记录WKY大鼠和SHR大鼠CASMCs膜表面混合钾电流(Kv通道电流和少量BKCa通道电流)、Kv通道电流、尾电流和静息电位,并绘制各种电流的I-V曲线、稳态激活曲线和稳态失活曲线。分析两组大鼠CASMCs上Kv通道电流特点及通道动力学特性。(4)提取WKY大鼠和SHR大鼠冠状动脉的RNA,并进行逆转录,利用实时荧光定量PCR反应(FQ-PCR)的方法比较两组大鼠Kv1.2和Kv1.5通道亚型的mRNA水平。(5)提取WKY大鼠和SHR大鼠冠状动脉总蛋白,采用蛋白免疫印迹方法(Western Blot)对两组大鼠Kv1.2和Kv1.5通道亚型的蛋白质水平进行比较。结果：(1)正常血压对照组WKY大鼠(n=79)平均体重为317±24.9克,尾动脉平均收缩压为118.44±3.75mmHg.高血压组SHR大鼠(n=66)平均体重为281±21.4克,尾动脉平均收缩压为192.52±11.06mmHg.血压水平在两组大鼠之间存在统计学差异(P<0.05)。(2)WKY大鼠CASMCs(n=30)的平均电容为17.48±2.59 pF,SHR大鼠CASMCs(n=25)的平均电容为15.44±2.68 pF,两组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。(3)WKY和SHR大鼠CASMCs静息电位平均值分别为-47.7±3.52 mV(n=11)和-34.5±1.69 mV(n=9)。静息电位在两组之间的差异存在统计学意义(P<0.05)。(4)按照混合钾电流刺激程序记录到WKY大鼠(n=7)在测试电位为+60 mV、+50mV、+40 mV、+30 mV和+20 mV时的电流密度分别为20.21±1.38 pA/pF、15.82±0.91 pA/pF、12.95±0.94 pA/pF、10.15±1.35 pA/pF和7.47±0.54 pA/pF,SHR大鼠(n=6)的电流密度分别为30.36±2.29 pA/pF、26.55±2.28 pA/pF、23.05±2.30 pA/pF. 18.19±1.98 pA/pF和13.30±1.03 pA/pF。相同电压下WKY大鼠混合钾电流的平均电流密度小于SHR大鼠,两组之间的差异存在统计学意义(P<0.05)。(5)在外液内加入BKca通道特异性阻滞剂IBTX后,记录Kv通道电流。得到WKY大鼠在测试电位为+60 mV、+50 mV、+40 mV和+30 mV时的电流密度分别为19.21±1.53 pA/pF、15.62±1.40 pA/pF、12.84±1.33 pA/pF和10.09±1.06 pA/pF,SHR大鼠的电流密度分别为28.56±1.93 pA/pF、24.70±1.31 pA/pF、19.90±1.16 pA/pF和15.79±1.09 pA/pF.相同电压下WKY大鼠的Kv通道电流平均电流密度小于SHR大鼠,两组之间的差异存在统计学意义(P<0.05)。(6)WKY大鼠Kv通道电流密度较自身混合钾电流密度轻度减小,在测试电位为+60 mV、+50 mV、+40 mV和+30 mV时平均下降百分比分别为4.94%、1.25%、0.87%和0.55%,加用阻滞剂前后电流密度的差异无统计学意义(P>0.05)。SHR大鼠Kv通道电流密度较自身混合钾电流平均下降百分比分别为5.94%、6.97%、13.67%和13.18%,两者之间电流密度的差异无统计学意义(p>0.05)。(7)按照尾电流刺激程序记录到WKY大鼠(n=5)在条件电位为+60 mV、+50 mV、+40 mV、+30 mV和+20 mV时的尾电流密度分别为17.54±0.76 pA/pF、11.89±1.25 pA/pF、9.85±0.55 pA/pF、7.54±0.42 pA/pF和5.20±0.95 pA/pF,而SHR大鼠(n=5)在相同的测试电位下的尾电流密度分别为26.95±2.46 pA/pF、24.40±1.37 pA/pF、19.73±1.56 pA/pF、16.59±0.55 pA/pF和9.08±0.54 pA/pF。相同电压下WKY大鼠的Kv通道尾电流平均电流密度小于SHR大鼠,两组之间的差异存在统计学意义(P<0.05)。(8)WKY大鼠Kv通道稳态激活曲线的半数激活电压V1/2=33.93±1.87 mV,SHR大鼠的半数激活电压V1/2=20.68±1.02 mV。两组之间的差异存在统计学意义(P<0.05)。WKY大鼠Kv通道稳态激活曲线的斜率因子k=15.19±1.81mV,SHR大鼠的斜率因子k=15.74±0.93 mV。两组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。(9)WKY大鼠(n=7)Kv通道稳态失活曲线的半数失活电压V1/2=-23.8±1.1 mV,SHR大鼠(n=5)半数失活电压V1/2=-20.08±1.28 mV。两组之间的差异无统计学意义(P>0.05)。WKY大鼠Kv通道稳态失活曲线的斜率因子k=14.72±1.01 mV,SHR大鼠斜率因子k=16.71±1.20 mV。两组之间的差异也无统计学意义(P>0.05)。(10)将WKY大鼠目的基因2-ΔACt值设定为对照值1,FQ-PCR反应显示SHR大鼠Kv1.2通道亚型mRNA的相对表达量是WKY大鼠的2.11±0.10倍。两组之间具有显著性差异(P<0.05)；SHR大鼠Kvl.5通道亚型mRNA的相对表达量是WKY大鼠的2.34±0.40倍。两组之间的差异存在统计学意义(P<0.05)。(11)经过内参GAPDH标准化,Western Blot发现WKY和SHR大鼠Kv1.2通道蛋白灰度比值分别为0.61±0.13和0.84±0.10；Kv1.5通道蛋白灰度比值则分别为0.47±0.10和0.96±0.07。Kv1.2和Kvl.5通道蛋白在两组之间的差异均存在统计学意义(P<0.05)。结论：经过研究表明,SHR大鼠CASMCs静息膜电位明显低于(负电位值减小)正常血压WKY大鼠,由于平滑肌细胞膜电位降低能够增加钙离子内流,使冠状动脉供血受损,因此标志着SHR大鼠冠状动脉壁张力明显高于WKY大鼠。但对SHR大鼠CASMCs复极电流的研究表明,混合钾电流和Kv通道电流都有所增大,明显大于WKY大鼠相应的复极电流。并且SHR大鼠Kv1.2和Kv1.5通道亚型mRNA和蛋白质的表达增加,与其电流改变的结果相一致,标志SHR大鼠冠状动脉壁舒张功能增强。复极电流增大可以增加膜电位(负电位值增大),减少钙离子内流,能够对抗管壁张力的上升,确保高血压负荷下的心肌供血。由此可见SHR大鼠CASMCs电生理适应性改变反映了高血压状态下冠状动脉循环自身调节的机制。