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H9N2亚型禽流感(Avian influenza,AI)既可引起肉仔鸡约30%的死亡率,也可引起蛋鸡和种鸡产蛋率的严重下降,给我国养禽业造成严重的经济损失。除感染禽类外,H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)还可感染人和其它哺乳动物。因此,该病的防控对公共卫生健康也具有重要作用。病毒感染的监测是疾病防控的重要手段之一,目前,流感病毒在人或不同动物中感染的监测方法主要包括RT-PCR,血凝和血凝抑制试验,ELISA等。临床上,血凝和血凝抑制试验被广泛应用于H9N2 AIV感染的监测和鸡群中疫苗免疫后抗体的评价。然而,该方法一方面需要制备红细胞且结果需主观判定;另一方面监测其它动物是否发生H9N2 AIV感染时,易产生假阳性。ELISA方法,具有操作简单、通量高的优点,已被广泛应用于H9N2 AIV感染的监测。但是依赖于传统抗体建立的ELISA方法,生产程序复杂,通常需要使用二抗以及二抗的标记,导致其价格较高,严重阻碍其商业化的推广使用。纳米抗体是骆驼体内重链抗体的可变区,具有分子量小、稳定性高、易于基因改造等优点。尤其是纳米抗体与不同报告基因进行融合已广泛应用于不同人和动物疫病的诊断中,该类方法往往操作简单且生产成本低。但H9N2 AIV却没有纳米抗体的筛选和利用纳米抗体建立诊断方法的报道。本课题通过原核表达H9N2-NP重组蛋白免疫双峰驼,构建噬菌体文库;然后,通过噬菌体展示技术筛选针对该蛋白的纳米抗体;随后,将筛选的纳米抗体与辣根过氧化物酶(HRP)进行融合表达,并利用其作为竞争抗体,建立了检测鸡血清中抗H9N2抗体的竞争ELISA。1:H9N2 AIV核衣壳蛋白(H9N2-NP)的原核表达和纯化利用合成的编码H9N2 NP蛋白的基因序列为模板,通过PCR扩增,酶切,连接和转化,构建H9N2-NP蛋白的原核表达重组质粒p ET-28a-H9N2-NP。将阳性重组质粒转化至大肠杆菌表达感受态细胞Transetta(DE3)中,IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE分析,成功表达获得了预期大小为56 k Da的可溶性重组蛋白H9N2-NP。Western blot分析H9N2-NP可以与阳性鸡血清发生特异性反应。重组蛋白经镍柱(Ni)纯化后,获得了3 mg/m L、纯度较高的重组蛋白H9N2-NP。2:H9N2-NP蛋白特异性纳米抗体的筛选和制备将纯化的H9N2-NP蛋白免疫阿拉善双峰驼,免疫5次后,采集免疫骆驼外周血,间接ELISA检测免疫骆驼血清中抗H9N2-NP蛋白的抗体效价达到1:128000;分离淋巴细胞,提取总RNA,巢式PCR扩增,双酶切,连接并电转化至TG1感受态细胞中,构建了库容为4.9×10~8个转化子的噬菌体文库。随后,通过噬菌体展示技术,经3轮淘选,成功筛选获得了5株抗H9N2-NP蛋白的特异性纳米抗体。阻断ELISA结果显示,纳米抗体H9N2-NP-Nb5能够明显被阳性鸡血清阻断其与抗原H9N2-NP蛋白的结合。3:基于纳米抗体检测血清中H9N2抗体竞争ELISA方法的建立与评价利用已建立的纳米抗体与HRP融合蛋白的快速表达平台,构建重组真核表达载体p CMV-N1-H9N2-NP-Nb5-HRP。然后,将阳性重组质粒转染至HEK293T细胞,经IFA和ELISA验证,纳米抗体H9N2-NP-Nb5与HRP融合蛋白成功表达并分泌到细胞上清中,并仍保持与H9N2-NP蛋白的反应性。随后,利用棋盘滴定法确定竞争ELISA方法的最佳的抗原包被量为100 ng/孔,Nb5-HRP和待检鸡血清的最佳稀释比例分别为1:320和1:10,最佳孵育时间为20 min,最佳显色时间为10 min,确定竞争ELISA的Cut-off值为14%。经验证该方法的敏感性为99.4%,特异性为100%,与已有的商品化方法的符合率为91.4%。建立的竞争ELISA适用于鸡血清中的H9N2抗体的监测。综上所述,本课题首次成功筛选制备了5株抗H9N2-NP蛋白的纳米抗体。然后,表达制备了抗H9N2-NP蛋白纳米抗体与HRP融合蛋白,并利用该融合蛋白建立了一种检测动物体内抗H9N2抗体的竞争ELISA方法,该方法操作简单、耗时短且具有良好的敏感性和特异性,可以应用于H9N2 AIV感染的血清学检测,为H9N2的防控奠定了基础。