C6/36DNV对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型相互作用的研究

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白纹伊蚊C6/36培养细胞浓核病毒(英文简称C6/36DNV)是本实验室在2002年发现的一株新的能感染白纹伊蚊的浓核病毒。该病毒属细小病毒科浓核病毒亚科短浓核病毒属,为二十面体单链DNA(4094 nt)病毒。在核苷酸和氨基酸序列上,它与埃及伊蚊浓核病毒(AaeDNV)有很高的同源性;但在基因结构和某些重复序列上,它更接近于白纹伊蚊浓核病毒(AaIDNV)。C6/36DNV能在C6/36细胞中长期潜伏和传代培养,其外表与正常细胞相比未发现有差异。本实验研究了该病毒对白纹伊蚊的致病性及其与登革病毒Ⅱ型之间的相互作用。 (1),用潜伏C6/36DNV的C6/36细胞(病毒DNA量为2.867×10<9>copy/m1)感染白纹伊蚊孵化后一日的幼虫24小时,在二十一天内幼虫平均死亡率达到97.46%。对孵化后一日的幼虫,则需要更长的感染时间(72小时)或更高的病毒浓度(病毒DNA量为6.1381×10<11>copy/m1),平均死亡率达到40.75%,幸存下来的蚊子实验证明携带此病毒。 (2),用荧光定量PCR方法研究了受C6/36DNV感染的白纹伊蚊体内病毒基因组量的动态变化,发现病毒基因组的量在感染后很快达到最高峰,之后逐渐下降;至幼虫发育为成蚊后,病毒基因组的量达到最低水平。这表明C6/36DNV不仅能致白纹伊蚊幼虫死亡,而且能潜伏在幸存的成蚊体内。对其后代幼虫和成蚊进行PCR测定,结果均为阳性,表明C6/36DNV在白纹伊蚊中能垂直传播。 (3),用DEN-Ⅱ感染潜伏了C6/36DNV的白纹伊蚊,发现C6/36DNV病毒量在感染DEN-Ⅱ后会急剧增加达数百倍至数千倍之多,这表明DEN-Ⅱ能够刺激潜伏在白纹伊蚊体内的C6/36DNV大量增殖。 (4),用DEN-Ⅱ分别感染潜伏C6/36DNV的白纹伊蚊和没有病毒潜伏的白纹伊蚊,分别提取蚊虫总RNA,随后将登革病毒RNA和白纹伊蚊看家基因核糖体蛋白rpL8RNA反转录为eDNA。用rpL8cDNA作为内标基因对登革病毒的量进行均一化校对,发现在潜伏了C6/36DNV的白纹伊蚊中,登革病毒基因组的量相对较低,而无病毒潜伏的白纹伊蚊中的登革病毒基因组量为前者的数百倍。这表明潜伏在白纹伊蚊体内的C6/36DNV能够抑制DEN-Ⅱ的繁殖。 (5)对感染C6/36DNV的白纹伊蚊进行病理学研究,在感染后第四天,电镜观察发现在脂肪体细胞的核内有大量病毒晶格状排列。随着时间的延长,在细胞质中也发现有病毒晶格体存在,同时伴有核膜扩张,核内异染色质增多的现象。之后,病毒开始感染到其它幼虫组织,如真皮细胞,肌肉细胞等,并且被感染的组织严重病变,核膜破裂,溶解;线粒体中空,肿胀,嵴溶解;内质网扩张,溶解;细胞开始死亡。 这一研究有望给白纹伊蚊的生物防治及控制登革病毒Ⅱ型的传播带来新的思路。
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