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对于骨缺损的修复,目前临床多采用自体骨移植和同种异体骨移植的方法,但是自体骨移植存在来源有限,二次手术的风险,异体骨移植会引起免疫排斥反应。为了解决这些问题,骨组织工程研究受到了普遍关注,并成为具有一定应用前景的治疗骨缺损的手段。骨组织工程研究要素包括种子细胞、骨诱导因子、支架材料选择以及三者的复合物,其中骨支架材料的设计和选择是该研究领域的基础环节。理想的骨支架材料应该具有良好的生物相容性、可降解性、骨传导性和足够的力学强度。此外,理想的骨支架材料还能够作为载体复合具有成骨诱导活性的生长因子,如骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein, BMP),使材料具有骨诱导活性。磷酸钙骨水泥(Calcium phosphate cements,CPC)因其与天然骨组织成份相同,且具有优良的生物相容性,可降解,易成型的优点,已被作为骨移植替代材料和BMP的载体材料应用于骨缺损的修复。然而,CPC材料由于其致密的结构,在体内吸收速度慢,不利于骨组织的长入,影响了骨组织的爬行替代过程。同时,由于缺乏多孔结构也限制了其作为支架材料在骨组织工程中的应用。事实上,支架材料的多孔结构设计是十分必要的。研究表明,骨支架材料的多孔结构对材料的生物学性能和机械性能有着重要的影响。但是,骨支架材料的最佳结构设计仍是材料研究和应用领域所需要解决的重要问题。孔径大小是骨生物材料的一项重要结构参数,这项参数对于细胞的增殖和黏附,以及随后的骨组织形成有着重要的影响。同时,考虑到BMP和骨移植材料的结合应用,必须明确载体材料孔径在调节复合的BMP的骨诱导活性,促进骨形成中的作用,以及孔径和BMP在改善骨移植材料成骨性和降解性中的协同作用。但是,有关这方面的研究较少。本课题采用盐析法制备了具有良好贯通的不同孔径大小的多孔CPC材料。在成功制备本实验所需材料的前提下,复合人工合成的重组骨形态发生蛋白2(recombinant human bone morphogenetic protein-2,rhBMP-2),通过比较不同孔径多孔CPC材料的体内骨诱导活性和降解性,研究BMP和材料孔径在影响载体材料的成骨性和降解性中的协同作用,探讨通过改变载体材料孔径从而调节BMP的骨诱导活性和材料降解性的可行性,为设计合理的材料结构提供理论参数。本课题主要从以下四个方面进行研究:1.复合rhBMP-2的多孔型与致密型活性CPC异位成骨比较研究本研究采用盐析法制备了一种多孔型CPC材料并复合rhBMP-2,与致密型CPC/rhBMP-2复合材料比较。将两种材料植入小鼠下肢肌肉内,并采用Micro-CT、组织学观察和荧光双标法分析两种活性材料的体内骨诱导活性和降解性,探索材料的多孔结构在影响成骨生长因子的使用效果及改变材料降解性中的作用。结果表明,与致密型材料相比,多孔型CPC材料复合rhBMP-2后表现出了更好的成骨活性,骨形成时间更早,各时间点所形成骨量更多,并且新骨形成的速率更快。这一现象可能与多孔结构更有利于rhBMP-2的释放,从而诱导更多的骨形成,以及优良的骨传导性促进骨向材料内的长入有关。另外,与致密型材料相比,复合rhBMP-2的多孔型CPC材料在体内表现出更快的降解性。以上结果提示,材料的多孔结构能够影响成骨生长因子的使用效果及改变材料的降解性。2.孔径大小对多孔磷酸钙人工骨材料降解性能的影响研究本实验的目的是研究孔径这一多孔结构的重要参数对材料降解性的影响,探讨通过改变支架材料孔径从而调节材料降解性和力学性能的可行性。实验采用盐析法制备了三种孔径不同但孔隙率相同的多孔CPC材料,并进行体外PBS浸泡试验和体内植入,对比研究了不同孔径材料在两种环境下所表现出的降解性的不同。结果发现,在体外试验中,大孔径材料表现出更好的溶解性,表现在质量损失更快,孔隙率的增加和力学强度的下降更为明显。但是,材料在体外介质中的降解是非常缓慢的。与体外不同的是,材料植入到体内后降解加快,而且孔径对于材料降解性的影响结果也不同。在体内,小孔径的材料表现出了更为明显的降解。这一结果提示,孔隙率一致的情况下,通过改变支架材料的孔径可以一定程度上调节材料的降解性和力学性能,但是这种影响在体外溶解介质中和体内环境是不同的。3.不同孔径CPC/rhBMP-2复合材料异位诱导成骨活性的比较研究本实验的目的是研究孔径对复合rhBMP-2的多孔CPC材料体内的骨诱导活性的影响。仍采用与前两项研究相同的方法制备了三种不同孔径的多孔CPC材料,孔径范围分别是200-300μm、300-450μm和450-600μm。通过比较rhBMP-2在三种不同孔径CPC载体材料中的体外释放动力学发现,载体材料孔径大小影响复合在材料上的rhBMP-2的释放,早期大孔径载体材料内的rhBMP-2的突释现象更为明显,而小孔径材料释放持续时间更长。将复合rhBMP-2三种孔径的载体材料植入肌肉内,采用Micro-CT、组织学观察和组织形态计量学分析对比了不同孔径载体材料上的rhBMP-2骨诱导活性。结果发现,不同时间点,不同孔径载体材料复合rhBMP-2后诱导形成的骨组织的分布和数量有明显差异。植入早期,形成的骨组织主要分布在材料外周。与小孔径材料相比,孔径大的载体材料外周包绕的新生骨组织容量更多。植入后期,相对于大孔径材料,孔径小的载体材料有更多的孔隙内有骨组织和类骨组织形成,而且孔隙内骨形成的速率较高,骨小梁较宽。以上结果提示,载体材料的孔径大小能够影响rhBMP-2的释放和体内诱导成骨活性。相对于大孔径材料,小孔径的载体材料更能够维持rhBMP-2的诱导骨形成能力持续较长时间。4.不同孔径多孔CPC/rhBMP-2材料修复兔松质骨缺损的比较研究本研究的目的是评价骨环境中,孔径对复合rhBMP-2的多孔CPC材料的骨形成和降解性的影响,探讨孔径大小和rhBMP-2在调节载体材料成骨性和降解性中的协同作用。本实验将制备的三种不同孔径(孔径范围分别是200-300μm、300-450μm和450-600μm)的圆柱状多孔CPC材料,复合rhBMP-2后植入兔松质骨缺损中,并与单纯材料作对比。于植入后4、12、20周行DR-X线、Micro-CT、组织学及组织形态计量学分析。结果发现,所有材料组的骨形成量和降解材料面积百分比随着时间的延长而增加。含有rhBMP-2的材料骨形成量、骨形成速度和降解速率均高于单纯材料组。不论是复合rhBMP-2的材料组还是单纯材料组,小孔径材料均具有较多的新生骨组织形成和较快的降解速率。所有材料中,200-300μmCPC/rhBMP-2材料的骨形成量最多,降解最快,20周时,材料已降解了52.5%。此时,含有rhBMP-2的材料内骨组织面积较12周时有所下降,可能由于骨组织的吸收重建造成。以上结果提示,支架材料孔径除了自身对骨形成和材料的降解性的影响,同时也可以通过影响rhBMP-2体内诱导成骨活性而影响骨组织的形成。支架材料的孔径大小和rhBMP-2在调节材料的成骨性和降解性中具有协同作用。