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背景与目的食管癌在全球恶性肿瘤的发病率排名第八位,死亡率排名第六位,我国是食管癌的高发区,发病率、死亡率高于全球平均水平。食管癌的临床治疗早期以手术联合放化疗为主,晚期以放化疗保守治疗,其中化疗药物主要为5-氟尿嘧啶和顺铂等。有些食管癌患者难以忍受化疗药物的毒副作用,还有患者固有耐药或获得性耐药,5年生存率低。因此,寻找新的治疗途径减少患者药物副作用对患者有重要意义。龙葵碱是以茄碱为糖苷配基的糖苷生物碱的一种成分,主要存在于马铃薯块茎或茄属植物中,摄入过量龙葵碱可引起中毒。一些研究表明,龙葵碱在不同类型的癌症中具有抗癌细胞转移的活性,其在乳腺癌动物模型中对小鼠具有保护作用。之前的研究表明,低剂量龙葵碱对细胞无明显作用,其可以增加食管癌细胞对放疗的敏感性,但其在食管癌化疗中的作用机制还有待进一步探索。microRNAs在很多肿瘤中具有调节作用,其通过靶向m RNA调控基因的转录后表达翻译,参与调节体内多种信号通路。研究发现mi R-138对多种肿瘤有抑制作用,包括前列腺癌,结直肠癌等。但其在食管癌中的作用上不明确。Survivin作为凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成员之一,可以通过直接抑制凋亡途径终末效应酶caspase-3/7的活性来阻断细胞凋亡过程,或则通过与周期蛋白激酶CDK2和CDK4相互作用来阻断凋亡通路。同时,survivin可以通过不同的细胞信号通路增加细胞的增殖活性。在大多数癌症(例如食管癌)类型细胞中,可以发现survivin蛋白的表达量升高,并且癌细胞拥有耐药性。目前,survivin被认为是抗癌研究的重要治疗靶点。本研究以5-氟尿嘧啶和顺铂为例,拟探索龙葵碱对食管癌细胞药物敏感性的影响,并分析龙葵碱对食管癌细胞中miR-138和survivin表达的影响,初步探讨龙葵碱对食管癌细胞药物敏感性的潜在分子调控机制。方法1.在37℃,5%CO2培养箱中培养食管癌细胞EC9706和KYSE30。2.用DMSO溶解龙葵碱,然后用细胞培养液稀释到终浓度为0μmol/L、2μmol/L、4μmol/L和6μmol/L,DMSO终浓度为0.1%;生理盐水溶解5-氟尿嘧啶和顺铂,5-氟尿嘧啶终浓度为0μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、30μg/mL、40μg/m L和50μg/mL,顺铂终浓度为0μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/m L、6μg/mL和8μg/mL。用不同浓度的龙葵碱和5-氟尿嘧啶或顺铂共处理食管癌细胞EC9706和KYSE30。3.用CCK-8实验对用不同浓度龙葵碱与不同浓度5-氟尿嘧啶或顺铂共处理的细胞进行增殖情况检测,判断不同浓度的龙葵碱对在不同浓度5-氟尿嘧啶或顺铂作用下的食管癌细胞的毒性影响。4.用流式细胞术试验对不同浓度龙葵碱与5-氟尿嘧啶(40μg/m L)或顺铂(6μg/mL)共处理的细胞进行凋亡情况检测,然后对各处理组细胞进行caspase3/7活性检测,研究不同浓度的龙葵碱对在5-氟尿嘧啶(40μg/mL)或顺铂(6μg/mL)作用下的食管癌细胞凋亡的影响。5.为研究龙葵碱对5-氟尿嘧啶和顺铂抑制裸鼠移植瘤增生的影响,用3.5mg/kg的龙葵碱和20mg/kg的5-氟尿嘧啶或3mg/kg的顺铂对荷瘤裸鼠进行为期4周的药物注射,用小动物成像仪器检测裸鼠荷瘤的生物发光强度,用免疫组织化学染色实验检测不同处理裸鼠荷瘤细胞中Ki-67的表达情况,评价龙葵碱对裸鼠荷瘤药物敏感性的影响。6.用荧光定量PCR方法检测在不同浓度龙葵碱作用下,食管癌细胞EC9706和KYSE30中miR-138和survivin mRNA的表达水平。用Western blotting检测survivin蛋白的表达情况。7.用Pearson相关性分析,探索不同浓度龙葵碱处理细胞后,细胞内miR-138和survivin mRNA表达量水平的相互关系。8.用生物信息学方法分析预测miR-138的作用靶点,设计Overlap突变引物,用PCR的方法扩增野生型及突变型survivin的3’UTR区目的基因,构建重组报告质粒,用双荧光素酶报告实验验证miR-138的作用靶点。9.为研究龙葵碱(4μmol/L),上调miR-138表达,下调survivin表达和抑制miR-138表达对食管癌细胞药物敏感性的影响,在5-氟尿嘧啶(40μg/m L)或顺铂(6μg/m L)作用下,用龙葵碱(4μmol/L)或用LipofectamineT M2000转染miR-138 mimic或si-survivin分别处理对数期生长的EC9706和KYSE30细胞,用龙葵碱和转染mi R-138共处理细胞,然后进行Western blotting实验检测不同处理细胞内survivin蛋白的表达情况,用CCK-8实验检测不同处理细胞的增殖情况。10.Survivin表达回复实验,构建无3’UTR区的pcDNA3.1-Survivin重组质粒,在5-氟尿嘧啶(40μg/m L)或顺铂(6μg/mL)作用下,分别用龙葵碱(4μmol/L),转染miR-138 mimic或无3’UTR区pc DNA3.1-Survivin重组质粒处理EC9706细胞,用Western blotting检测各组细胞survivin蛋白的表达情况,用CCK-8检测各组细胞的增殖情况,用流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况,分析龙葵碱/miR-138/survivin对食管癌细胞药物敏感性的作用影响机制。11.用SPSS 21.0软件对各实验结果数据进行统计学分析,以α=0.05作为显著性检验标准。结果1.CCK-8结果显示不同浓度龙葵碱对食管癌细胞EC9706和KYSE30无明显细胞毒性,且不同浓度龙葵碱能够提高不同浓度5-氟尿嘧啶或顺铂对食管癌细胞的细胞毒性(P<0.05)。2.流式细胞术显示龙葵碱与5-氟尿嘧啶或顺铂共处理组细胞凋亡率(34-42%)显著高于5-氟尿嘧啶或顺铂单独处理组细胞凋亡率(23-28%)(P<0.05),caspase3/7活性检测显示龙葵碱与5-氟尿嘧啶或顺铂共处理组细胞caspase3/7活性显著高于5-氟尿嘧啶或顺铂单独处理组(P<0.05),结果表明龙葵碱能够提高5-氟尿嘧啶或顺铂对食管癌细胞EC9706和KYSE30的凋亡诱导作用。3.裸鼠荷瘤结果显示龙葵碱单独作用与空白对照组的荷瘤生物发光强度曲线无明显差异,龙葵碱与5-氟尿嘧啶或顺铂共处理组比5-氟尿嘧啶或顺铂单独处理组的荷瘤生物发光强度显著降低(P<0.05),免疫组织化学染色实验显示各组细胞中Ki-67的表达量结果同荷瘤生物发光强度检测结果,表明龙葵碱能够增强裸鼠荷瘤对5-氟尿嘧啶和顺铂的化疗敏感性。4.荧光定量PCR和Western blotting实验结果显示,龙葵碱能上调食管癌细胞中miR-138的表达,下调食管癌细胞中survivin mRNA及其蛋白的表达(P<0.05)。5.Pearson分析结果显示,龙葵碱作用于食管癌细胞后,miR-138和survivin m RNA的表达量呈负相关关系(R~2=0.710,P<0.05)。6.生物信息学分析发现mi R-138和survivin的3’UTR区存在互补结合区域,经双荧光素报告酶实验证实survivin是miR-138的靶基因。7.Western blotting结果显示,在用5-氟尿嘧啶或顺铂处理同时,加入龙葵碱与转染miR-138 mimic均可使survivin蛋白的表达量显著下降,转染si-survivin能够有效抑制survivin蛋白的表达(P<0.05);而转染mi R-138 inhibitor与用龙葵碱处理共同作用时,survivin蛋白的表达量显著高于用龙葵碱处理组(P<0.05)。细胞增殖实验显示,用龙葵碱处理、转染mi R-138 mimic和转染si-survivin均能提高5-氟尿嘧啶或顺铂对EC9706和KYSE30细胞的细胞毒性,使细胞的增殖率显著下降(P<0.05);而转染miR-138 inhibitor与用龙葵碱处理共同作用时,细胞的增殖率显著高于用龙葵碱处理组(P<0.05)。结果表明,龙葵碱通过上调miR-138表达下调survivin蛋白表达促进食管癌细胞EC9706和KYSE30对5-氟尿嘧啶或顺铂的化疗敏感性。8.Survivin表达回复实验结果8.1 Western blot结果显示,用龙葵碱处理或转染mi R-138 mimic均能减少survivin的表达量,但转染pcDNA3.1-Survivin重组质粒后,各组细胞的survivin表达量均显著升高(P<0.05),pc DNA3.1-Survivin重组质粒逆转了龙葵碱和miR-138 mimic抑制survivin表达的作用。8.2 CCK-8结果显示,用龙葵碱处理或转染miR-138 mimic均能增加5-氟尿嘧啶或顺铂对食管癌细胞EC9706的细胞毒性,但转染pc DNA3.1-Survivin重组质粒后,各组细胞5-氟尿嘧啶或顺铂对EC9706细胞的细胞毒性均显著减小(P<0.05)。8.3流式细胞术结果显示,在5-氟尿嘧啶或顺铂作用下,用龙葵碱处理或转染miR-138 mimic均可增加EC9706细胞的凋亡率,但转染pcNDA3.1-Survivin重组质粒后,各组细胞的凋亡率均显著下降(P<0.05)。结果表明,回复survivin表达能逆转龙葵碱通过上调miR-138下调survivin表达促进食管癌细胞化疗敏感性的作用。结论Survivin是miR138的靶基因,龙葵碱可以通过上调miR-138表达,抑制survivin的表达,从而增强食管癌细胞系EC9706和KYSE30对5-氟尿嘧啶和顺铂的药物敏感性。