转基因水稻种子的比较蛋白质组研究及水稻OsRAD21-2的功能分析

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:qiang860412
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水稻是世界上最重要的粮食作物之一,是我国第一大粮食作物。随着分子遗传学研究的深入与转基因技术的完善,转基因技术已成为改良水稻等作物农艺性状的重要技术手段,但是转基因修饰的农作物在农业生产中的应用目前仍然存在很大争议,争议的焦点在于转基因是否会带来非预期效应,给人类健康造成危害,在这种情形下对转基因农作物进行安全性评估尤为重要。目前评估转基因作物安全性的手段主要是靶定成份的分析,但是,客观、全面评估转基因对作物分子特征稳定性的影响以及影响程度关系到转基因作物的产业化以及社会对转基因作物安全性的关切,是目前急待解决的问题。蛋白质组学技术因其更高的通量而在转基因作物安全性评估领域越来越受到关注。为了全面评估转基因对受体作物蛋白质组的影响,我们建立了基于荧光标记蛋白质的双向电泳(2D-DIGE)技术评估转基因水稻蛋白质组变异的蛋白质组方法,系统比较了转抗除草剂bar基因水稻Bar68-1及其对照D68,转双价抗虫基因crylAC/Sck水稻2036-1a及其对照明恢86种子蛋白质组的差异。同时为了比较自然进化以及常规遗传育种对水稻种子造成的影响,我们的研究中还包括了两种不同籼梗水稻:籼稻明恢63和粳稻中花10号。PCR分析证实Bar68-1和2036-1a基因组包含转入的外源基因,半定量RT-PCR分析结果表明bar和crylAc/sck在相应的转基因水稻叶、根和种子中表达,在种子中表达水平低。种子蛋白质的2D-DIGE分离以及蛋白质组的比较与统计分析显示,转基因水稻与其对照之间的差异蛋白质数量远少于不同品系之间的差异蛋白质数量,并且转基因水稻与其对照之间差异蛋白的很大一部分与常规品系间的差异蛋白是重叠的。差异蛋白质的主成分分析结果表明这些差异蛋白质可以显著区分四个常规品系,但是无法区分转基因水稻与其对照;同时主成分分析得到了差异贡献率达到77.7%的前三个主成分,基本涵盖了原有的变量信息,其中第一主成分对D68与其他3个品系差异的贡献最大,第二个主成分对粳稻中花10号与其他3个籼稻差异的贡献最大,第三个主成分则对2个明恢品系差异的贡献最大。质谱分析鉴定到了238个差异表达的蛋白质和14个坐标蛋白质,蛋白质功能分类结果显示参与新陈代谢、蛋白质折叠修饰以及防御反应相关的蛋白质在差异蛋白质中占很大比例,分别为30.7%、24%和21.7%,说明这三个代谢或细胞学过程在不同环境下变化最为明显。聚类分析以及表达模式分析显示不同功能类的蛋白在不同品系中分布不均匀,这也暗示不同品系中代谢活动的差异。我们鉴定到的236个单个蛋白中176个蛋白具有同工型,通过这些同工型的表达分析显示不同品系之间蛋白质表达的差异很大程度上是由于蛋白质经过了修饰造成的。在鉴定差异蛋白的同时,我们选择了14个在所有样品中表达没有变化的坐标蛋白,通过鉴定分析发现5个坐标蛋白与其他差异蛋白质组成了5个同工型家族,这也证实了品系之间的差异是由于蛋白质在不同环境中经过不同修饰造成。以上结果表明,转基因没有显著影响受体的蛋白质组,转基因水稻与其对照之间的蛋白质组差异远远小于自然进化或遗传育种造成的蛋白质组差异。   Rad21与其减数分裂同源蛋白Rec8是黏着素复合体的重要元件,分别对有丝分裂和减数分裂过程中的姊妹染色单体黏着和染色体分离至关重要。与含有2个RAD21/REC8基因的酵母和脊椎动物不同,水稻基因组编码4个Rad21/Rec8蛋白质。我们初步分析了OsRAD21-2的功能。系统进化分析结果显示OsRad21-2是植物特异的Rad21亚家族。半定量RT-PCR显示OsRAD21-2在减数分裂前的花中优势表达。RNA原位杂交实验与启动子::GUS染色实验结果表明OsRAD21-2在细胞分裂旺盛的组织,包括减数分裂前雄蕊、茎居间分生组织、叶分生组织、和根中柱鞘细胞中优势表达。该基因在酵母细胞中表达导致转基因酵母细胞生长延迟、形态异常,并在G2期受到阻滞。OsRAD21-2-RNAi株系侧根数目少于野生型对照。OsRad21-2对水稻侧根生长的调控机制还有待于进一步研究。我们的结果显示OsRad21-2在细胞分裂与生长中起调控作用。
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