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目的：我国慢性肝病中主要以慢性乙型肝炎最多，由于肝炎病毒复制，病毒刺激机体的免疫防御系统，导致免疫防御系统的淋巴细胞在清除病毒时，“误伤”肝细胞，产生肝脏内炎症，从而诱导了纤维组织过度增生，致使肝纤维化。肝纤维化的病理改变主要是细胞外基质过度沉积在肝脏中，大多数慢性肝病有不同程度的肝纤维化，这是一种常见的病理基础，表现为肝细胞胶原蛋白等细胞外基质合成增加，降解相对不足，从而使细胞外基质过度沉积在肝脏中。如果进一步发展则会引起肝小叶改建，假小叶结节形成，其中25％40％最终发展成肝硬化和肝癌。因此，在治疗慢性肝病时阻断肝纤维化已成为一个关键的问题。肝纤维化是多种慢性肝病发展至肝硬化共同的病理基础，而目前常规肝功能检查只能反映肝脏功能，无法测知肝纤维化程度。依据肝穿刺活体组织检查，也难以对肝纤维化进行动态观察及疗效评估。真核肽链释放因子是在真核生物中参与细胞内蛋白质合成终止过程中新生肽链释放的一组重要的蛋白质，包括两类，即eRF1和eRF3。有研究显示，eRF3a/gspt1是哺乳动物翻译终止过程中的主要因子，它的表达水平影响eRF1蛋白的稳定性，并且决定着终止复合物的形成，因此我们在此次试验中调节了eRF3a/gspt1的表达水平，观察不同的eRF3a/gspt1的表达水平是否对肝纤维化产生影响。方法：1gspt1基因克隆。采用DNA提取试剂盒提取大鼠全基因组DNA，PCR扩增获得gspt1。将gspt1基因克隆至eGFP-C2载体，应用碱裂解法提取质粒，进行双酶切鉴定及测序分析。2肝纤维化模型建立。100只SD大鼠腹腔内注射5%四氯化碳与橄榄油的混合物，剂量为5ml/kg，每周两次，注射8周。造模过程动物饲水中加入25mg/L的苯巴比妥。正常对照组大鼠14只，按模型建立组的同样程序腹腔内注射橄榄油8周。模型大鼠CCL4处理四周之后分别用构建的重组质粒处理、秋水仙碱阳性对照处理，其中质粒处理组分为5个亚组：CCL4+eGFP-C2-gspt1质粒0.125mg/kg每周一次组（treated1）、CCL4+eGFP-C2-gspt1质粒0.125mg/kg每周两次组（treated2）、CCL4+eGFP-C2-gspt1质粒0.25mg/kg每周一次组（treated3）、CCL4+eGFP-C2-gspt1质粒0.25mg/kg每周两次组（treated4）、CCL4+eGFP-C2-gspt1质粒0mg/kg每周一次组（模型组），每组12只大鼠，经尾静脉快速注射质粒；阳性对照组为秋水仙碱，共14只，0.14mg/kg灌胃，1次/天；阴性对照组为注射CCL4+eGFP-C2质粒0.125mg/kg每周一次组，共12只大鼠。观察重组质粒对肝纤维化的治疗作用。3肝功能检测。留取血清，使用微板法检测AST、ALT等肝功指标变化情况。4肝组织病理检测。第8周实验结束后，提取大鼠肝组织，进行石蜡包埋，分别行厚度5μm的连续切片，之后进行HE染色和免疫组织化学染色，镜下观察肝组织病理变化。5肝纤维化相关因子基因表达量检测。采用荧光定量PCR（Real-TimeRT-PCR）2-ΔΔCt相对定量方法检测纤维相关因子α-SMA、TGF-β1、CTGF、MMP13、ColΙ在大鼠肝脏中的相对表达水平。以GAPDH基因作为内参，将标本间RNA的质量和逆转录效率的差异进行标准化。以各因子在正常组大鼠肝组织中的表达水平作为校准样本，比较各组织中表达水平的差异。6肝纤维化相关因子蛋白表达量检测。采用Western blot检测eRF3a和α-SMA的表达水平，以β-actin为内参，比较各处理组中蛋白的表达水平的差异。结果：1gspt1基因克隆。本课题成功克隆出真核肽链释放因子gspt1基因。大鼠gspt1基因的编码区由1911个碱基组成，编码637个氨基酸，推测其相对分子质量约为80KD。2肝功能检测。模型建立八周后取血清检测AST、ALT水平发现与模型组相比质粒处理组AST、ALT随剂量增大而下降。3肝组织病理检测。HE染色结果显示正常对照组大鼠肝小叶结构清晰，肝细胞多为单核，在小叶间和汇管区基本无胶原纤维分布,仅在中央静脉及肝窦内有轻微的胶原纤维分布。模型组大鼠HE染色中可见肝组织正常肝小叶结构被破坏，肝细胞索排列紊乱，汇管区扩大，大量炎症细胞浸润，广泛脂肪变性，肝细胞肿胀，小叶间和汇管区胶原纤维明显增生。质粒处理组大鼠HE染色与模型组相比较可见，随剂量加大，胶原纤维明显减少，炎细胞浸润逐渐减少，变性的细胞逐渐减少。4肝纤维化相关因子基因表达量检测。实时荧光定量PCR结果显示质粒处理组纤维相关因子α-SMA、CTGF、TGF-β1、Col Ι表达水平均明显低于模型组，MMP13表达水平明显高于模型组，其中treated2、treated3、treated4中CTGF表达水平明显低于模型组（P=0.01），且treated4中CTGF表达水平明显低于与其它组（P=0.04）；treated3和treated4中TGF-β1表达水平明显低于模型组（P=0.01），而这两组间TGF-β1表达水平没有差异；treated3和treated4中ColΙ表达水平明显低于模型组（P=0.02），而treated3、treated4之间ColΙ表达水平没有差异；treated3、treated4中α-SMA表达水平明显低于模型组（P=0.01），而treated3和treated4之间α-SMA表达水平没有差异；treated3和treated4中MMP13表达水平明显高于模型组（P=0.01），而treated3和treated4之间MMP13表达水平没有差异。5肝纤维化相关因子蛋白表达量检测。Western Blot检测eRF3a蛋白、α-SMA表达情况，可见eRF3a蛋白特异性条带，位于72KD以及95KD之间，大约为80KD左右，计算eRF3a/β-actin的比值，正常组、模型组、阴性组、阳性组和四种质粒处理组（treated1、treated2、treated3、treated4）的相对表达量分别为0.98、0.77、0.72、1.44、0.80、0.92、1.40、1.67，其中treated3、treated4中eRF3a蛋白表达水平高于模型组（P=0.03）且treated4中eRF3a蛋白表达水平高于treated3（P=0.02）；α-SMA蛋白特异性条带，大约为44KD左右，计算α-SMA/β-actin的比值，正常组、模型组、阴性组、阳性组和四种处理组的相对表达量分别为0.80、1.17、1.21、0.87、1.54、1.32、1.28、1.05，其中treated3和treated4中α-SMA蛋白表达水平明显低于模型组（P=0.01），且这两组之间α-SMA蛋白表达水平没有差异。结论：1对大鼠肝纤维化模型给予eGFP-C2-gspt重组质粒处理4周后AST、ALT等生化指标活性有所下降,说明大鼠肝组织功能损伤程度逐渐改善。2肝组织病理学检测可见eGFP-C2-gspt1质粒处理组大鼠肝组织损伤程度减轻，且随给予质粒剂量增大损伤程度减轻。3eGFP-C2-gspt1重组质粒处理4周后大鼠肝组织促肝纤维化相关因子表达水平有所下降，而抑纤维化因子表达水平升高。提示eRF3a/gspt1对大鼠的肝纤维化有一定的抑制作用。