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极端嗜盐古菌由于其独特的遗传和生理生化特性，特殊的进化地位和广阔的应用前景，正引起微生物学家及生物工程学家越来越多的关注。为了深入认识和利用这类微生物，本论文开展了极端嗜盐古菌质粒的复制机制的系统研究。
1.滚环复制质粒pZMX201和pNB101的复制起始研究。
对来源于极端嗜盐古菌Natrinema Sp.CX2021的质粒pZMX201(1668 bp)进行序列分析发现其只含有一个可能编码Rep蛋白的阅读框。序列比对发现该Rep蛋白与其他极端嗜盐古菌滚环复制质粒的Rep蛋白具有相似性，Southern杂交实验检测到pZMX201在复制过程中产生典型的滚环质粒的单链复制中间体，因而推测pZMX201为极端嗜盐古菌滚环质粒家族的新成员。用透射电镜观察到了pZMX201的σ复制中间体，并初步推断其双链复制起始点(DSO)位于NcoI酶切位点附近。在此基础上，用DSO mapping实验确定了pZMX201的精确DSO nick位点(C404/G405)位于NcoI酶切位点下游100 bp的一个发夹结构的配对区。与其他嗜盐古菌滚环质粒进行比对发现该nick位点位于保守的TCTC/GGC(斜杠处为nick位点)序列中，说明本家族质粒的DSO nick位点具有序列保守性。结合本实验室分离的另一个嗜盐古菌滚环质粒pNB101，构建了一系列杂合质粒，发现pZMX201和pNB101的Rep蛋白和DSO在滚环复制起始和终止过程中能够交叉识别。在所构建的杂合质粒基础上，深入研究了pZMX201的DSO(DSOz)序列的功能发现：(1)保守的TCTC/GGC序列中靠近中部的序列(CTCG)对DSOz的复制起始和终止功能更重要；(2)DSOz的发夹结构中左半部分序列为复制起始功能所必需，但不是复制终止功能所必需；(3)仅36 bp长的包含TCTC/GGC和下游重要序列的DSOz片段就能够在复制终止中起作用。综合序列分析和实验结果，发现极端嗜盐古菌中滚环质粒的复制元件具有区别于细菌滚环质粒和ssDNA噬菌体的新特征，可作为很好的研究滚环复制子进化的模型。
2.θ复制质粒pZMX101与pSCM201复制子的比较研究。
对分离于极端嗜盐古菌Halorubrum saccharovorum的质粒pZMX101(3918 bp)进行序列分析后，发现该质粒含有六个编码酸性蛋白的阅读框，其中最大的阅读框ORFA(repA)可能编码质粒的复制蛋白(RepA)。序列比对发现RepA与本实验室分离于一株Haloarcula的θ复制质粒pSCM201具有40％相似性，表明pZMX101可能也是θ复制质粒。以pZMX101作为唯一的嗜盐古菌复制子，我们构建了穿梭载体pZMX108并成功转化Haloferax volcanii，同时发现pZMX108在宿主Hfx.volcanii中具有很好的稳定性。为了得到pZMX101的最小复制子，用PCR扩增pZMX101不同片段，构建了一系列重组质粒(pZMX109-pZMX114)并转化Hfx.volcanii。结果表明pZMX101最小复制子为重组质粒pZMX112所含片段，即包含ORFA和其上游400 bp与下游300 bp序列。对pZMX101最小复制子进行序列分析发现ORFA上下游有零散的正反向重复序列，但与质粒pSCM201的复制起始区比较没有发现典型的同源序列。通过转化不同的嗜盐菌受体菌，我们还发现基于pZMX101只能转化Hfx.volcanii，而pSCM201则只能转化与其天然宿主进化距离较近的Har.hispanica。这种宿主范围的不同取决于复制起始区DNA序列还是Rep蛋白，或是宿主蛋白的参与?对质粒pZMX101和pSCM201的深入研究将有助于进一步揭示极端嗜盐古菌中质粒和宿主相互关系的精密机制。