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高尔基体结构和功能的维持依赖高尔基体基质蛋白。蛋白Golgin是一类具有coiled-coil结构域的蛋白,参与高尔基体囊泡运输及其装配过程。GM130和Golgin-84是golgin家族的两个成员,在高尔基体形成的过程中起很重要的作用。Golgin蛋白能发生多种翻译后修饰,如磷酸化等,调节高尔基体的结构和功能。报道指出golgin蛋白能被甲基化修饰,但是目前负责催化它的酶和功能的研究尚未清楚。
PRMT5是蛋白质精氨酸甲基化转移酶家族成员之一,在细胞质和细胞核中均有定位。目前的研究表明其参与细胞转录、RNA剪切等重要细胞生理过程。但研究主要集中在PRMT5在细胞核内的功能。我们主要关注PRMT5在细胞质中的功能研究。我们质谱分析细胞质中的PRMT5复合体,发现与高尔基体结构有关蛋白,其中包括GM130蛋白。为了进一步研究PRMT5是否影响高尔基的结构和功能,我们进行如下实验。
我们证实了GM130和PRMT5存在于一个复合体中,并且GM130的N端可以和PRMT5相互作用；PRMT5依赖GM130定位于高尔基体；进一步研究PRMT5的功能,发现PRMT5通过甲基化转移酶活性影响高尔基体的结构；此外,当PRMT5沉默,高尔基体蛋白GM130表达水平下调,而且golgin-84蛋白大小发生变化,可能有磷酸化的修饰。
首先,体外活性试验证明GM130是PRMT5的底物,体内标记试验也进一步验证GM130在体内被PRMT5甲基化。为了进一步研究PRMT5如何通过甲基化GM130蛋白来调控高尔基体的结构,我们转染GM130野生型和GM130-R6KR18KR23K甲基化位点突变体以及可以GM130组成型甲基化突变体GM130-R6FR18FR23F于细胞中,通过统计我们发现GM130的甲基化有利于高尔基体ribbon的形成；而且检测了GM130的野生型和甲基化突变体蛋白质的稳定性发现,GM130的野生型确实要比GM130的甲基化位点突变体要稳定一些。我们推测PRMT5可能是通过甲基化GM130,增加GM130的稳定性来影响高尔基体ribbon的形成。
PRMT5的沉默影响高尔基体的结构,同时检测到golgin-84蛋白大小有变化,根据文献报道,golgin-84存在精氨酸甲基化修饰的位点。通过体外甲基化实验证明PRMT5可以甲基化Golgin-84 R28和R88。但是我们将golgin-84的野生型和甲基化位点突变体转入细胞中,并没有发现明显的高尔基体结构改变。Golgin-84的精氨酸甲基化修饰如何调控高尔基体的结构,还有待于进一步的研究。
综上,本研究发现了PRMT5可以甲基化高尔基体上的蛋白GM130和golgin-84。PRMT5通过甲基化GM130来影响其蛋白的稳定性,来调节高尔基体的结构。同时本研究揭示了golgin家族与PRMT5之间的相互作用关系及其在调节高尔基体生物发生中的作用。