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蛋白类激发子elicitins是一类由卵菌纲的疫霉属和腐霉属真菌分泌的小分子蛋白,在非亲和性植物与疫霉、腐霉互作中起着重要的作用。低浓度elicitins就可以诱导烟草产生过敏反应(hypersensitive response, HR),并进一步诱导烟草产生系统获得性抗性等生物学效应,研究认为elicitins诱导的细胞死亡不需要氧爆发参与。Parasiticein (ParA1)是由寄生疫霉分泌的elicitin类激发子,外源表达ParA1注射烟草,也可以产生相同的生物学效应。因此,外源表达并获得单一有活性的ParA1蛋白可以用于研究植物-病原真菌互作。核黄素是一种重要的水溶性维生素。核黄素和其衍生物可以作为辅基参与生物许多以氧化-还原为特征的生理生化反应。此外它还是一种光敏物质,可以被紫外光诱发产生单线态核黄素和三线态核黄素,作为电子供体与氧气分子结合形成活性氧如超氧阴离子、过氧化氢等。活性氧在植物中也具有很重要的作用。当植物受到病原菌侵染后,氧爆发是植物响应病原菌侵染的最早期事件之一,产生的活性氧参与细胞壁加固、脂质氧化、防卫基因激活及防卫信号传递等一系列重要生理过程。本实验室发现在光照条件下核黄素与ParA1共同注射可以抑制ParA1诱导的烟草HR,本研究主要对此现象的产生机制做初步解析。1.ParA1蛋白在毕赤酵母中的表达为了获得单一有活性的ParA1蛋白,本实验室首先采用表达效率比较高的原核表达系统,但是表达的ParA1蛋白产量较低,不足以进行后续试验。根据已有研究,我们采用真核蛋白表达系统——毕赤酵母表达ParA1蛋白。我们首先构建蛋白胞内表达和胞外表达两种重组质粒(pPICZ(α)A系列),将重组质粒和相应的空载体由电击转化到野生型菌株X-33和突变菌株KM71H中,进行蛋白表达。通过对不同转化子的蛋白预表达和活性检验,结合后续蛋白纯化过程,我们选择KM71H转胞内表达载体为最后蛋白表达系统。经过镍柱纯化,我们在蛋白电泳图谱中得到了单一、清晰的蛋白电泳条带,且蛋白浓度约为75ng/μl。在烟草上注射表达纯化的蛋白观察HR表型,结合蛋白电泳,我们认为此蛋白即是表达的目的蛋白,而且具有较高的生物学活性,稀释6000倍后仍可以在烟草上引发HR。2.核黄素抑制ParA1诱导的烟草过敏反应核黄素和ParA1共同注射烟草叶片,在持续光照24h后,发现核黄素抑制ParA1在烟草上诱导的细胞死亡。检测核黄素注射到烟草叶片并光照1.5h后注射位置的H202含量,发现该位置的H202含量是空白对照的约1.4倍,DAB染色得到相似结论。不同活性氧清除剂与ParA1和核黄素共同注射,catalase,抗坏血酸和还原型谷胱甘肽可以恢复核黄素对HR的抑制作用,而超氧化物歧化酶则不能恢复；但是外源H2O2与ParA1共注射,对HR的抑制效果不明显。进一步用羟自由基清除剂硫脲、腺嘌呤和组氨酸分别与ParA1和核黄素共同注射烟草叶片,都可以恢复核黄素对HR的抑制；同时外源羟自由基可以抑制ParA1诱导的HR。因此我们初步认为羟自由基影响ParA1诱导的烟草HR信号传导,从而抑制ParA1诱导的烟草HR。