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脑卒中特别是缺血性脑卒中、各种心脏疾病以及恶性肿瘤成为多数国家三大主要死因。脑卒中根据发病机制的不同分为脑血栓形成、脑栓塞和血流动力学障碍所致的脑梗死。在临床实践中发现,脑血栓形成是脑梗死最常见的病理生理过程。脑血栓形成与血管内皮细胞损伤有密切关系。正常血管被完整的血管内皮细胞所覆盖,正常的血管内皮细胞本身具有抑制血小板聚集、抑制血栓形成的功能。当血管内皮细胞受到内外刺激导致的氧化应激损伤时,会导致内皮细胞的异常凋亡,使得内皮下的组织暴露,进而导致血小板的聚集,血栓形成,相应的血管供应区血流中断,发生缺血、缺氧性的变性坏死。脑部供血血管内皮细胞的损伤,导致脑部组织局灶性的缺血,产生相应神经功能缺损的症状和体征。因此,抑制因氧化应激导致的内皮细胞凋亡成为临床治疗缺血性脑卒中的新思路。实验目的1、探讨半胱胺对内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制。2、探讨半胱胺对缺血性脑卒中的保护作用及其分子机制。研究方法1、我们根据脑血栓形成的原理在体外模拟内皮细胞损伤的过程。体外培养人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。待细胞贴壁后将各细胞株随机分为对照组、玫瑰红组、玫瑰红+光照组、半胱胺组、半胱胺保护组。相差显微镜观察各处理组细胞形态及密度的变化;台盼蓝染色法检测不同处理条件下细胞活性改变;流式细胞仪检测细胞凋亡与细胞周期的变化;荧光定量法检测caspase活性改变;DCFH-DA检测细胞内ROS的累积;Western blotting方法检测相关蛋白。2、根据脑血栓形成可致脑卒中的原理,采用光化学法制备脑卒中模型。随机分成假手术组、模型组和半胱胺组。经过不同处理于1天、2天、3天后,采用Zea Longa评分法、足失误试验及圆筒实验等对各处理组进行神经功能及行为学评分;通过3天后TTC染色及相关软件分析观察脑梗死灶,测定梗死体积;采用干湿重法检测大脑组织含水量;通过免疫荧光染色法检测缺血侧脑组织中MPO、AQP4表达含量。结果1.相差显微镜下观察,半胱胺保护组与光氧化损伤组相比,细胞形态发生明显变化,死亡细胞明显减少。台盼蓝结果显示,与正常细胞相比,光氧化损伤组细胞活性降低,半胱胺可以提高细胞活性,差异均具有统计学意义(P<0.05)。流式细胞仪检测结果显示,光氧化损伤组导致了明显的凋亡,给予半胱胺保护后凋亡峰Sub-G1峰降低。DCFH-DA染色后发现,光氧化损伤组细胞内ROS的含量增加,给予半胱胺保护后细胞内ROS的含量较前降低。Western blotting结果表明,半胱胺保护组,DNA功能损伤相关蛋白ATM、ATR、p53表达降低,线粒体介导的凋亡途径相关蛋白caspase-3、-7、-9表达降低,MAPK/AKT信号通路相关蛋白p38/JNK表达减少,与此同时ERK/AKT表达增多。2.模型组与半胱胺组相比,在术后的1天,2天,3天神经功能缺损情况及行为学均得到显著改善,且差异具有统计学意义。TTC染色结果显示半胱胺组脑梗死体积较模型组减小。在术后3天,半胱胺组的脑组织含水量较模型组明显减少。通过免疫荧光染色法对脑组织中AQP4和MPO的浸润情况进行定性观察,结果显示假手术组脑组织中可见少量的散在分布的AQP4和MPO阳性表达的细胞,半胱胺组与模型组相比较AQP4和MPO阳性表达的细胞的数量明显减少。结论1.体外用光化学法构建了稳定的内皮细胞损伤模型;半胱胺可通过抑制ROS介导的DNA损伤及调控MAPK和AKT信号通路抑制光氧化诱导的内皮细胞凋亡。2.半胱胺对小鼠早期脑缺血有保护作用,可减轻缺血性脑卒中后神经功能缺损程度,可显著降低脑卒中后脑梗死体积,可减轻脑梗死引起的脑水肿。3.半胱胺有望发展成为高效、低毒、作用机制明确的脑卒中防治药物,可在临床中得到广泛应用。