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丹参为唇形科植物丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)的干燥根和根茎,是大宗常用药材,对于心脑血管疾病有显著疗效。其主要的药效成分之一为丹参酮,一种脂溶性松香烷二萜类化合物。丹参作为重要的药用模式植物,其活性成分丹参酮的生物合成途径及合成生物学研究在国际上备受关注,但由于丹参酮结构高度氧化的特性,其生源途径仍未完全解析,涉及多步氧化酶的催化,如CYP450s等。课题组基于二代和三代测序技术成功获得丹参基因组图谱,并得到全长转录组测序数据,本研究利用基因组学、转录组学、代谢组学和生物信息学等多组学技术对丹参酮生物合成途径中关键酶基因进行筛选挖掘和功能研究。1.基于丹参基因组和转录组数据,结合丹参中CYP450s的系统发育共鉴定到161个丹参CYP71clan成员,分为16个家族,其中数量最多的是CYP71家族(64个),其次为CYP76家族(28个)。转录组表达分析显示CYP71clan中36.00%的基因高表达(FPKM>10)。克隆到基因SmCYP71AU66和SmCYP76AK5,全长均为1503 bp,编码500个氨基酸,转录组及实时定量PCR结果显示SmCYP71AU66和SmCYP76AK5在丹参根的周皮部位显著高表达,符合丹参酮在丹参体内的分布规律,推测其参与丹参酮生物合成途径。2.本研究构建SmCYP76AK5基因的RNAi丹参遗传转化体系。采用实时定量PCR实验检测RNAi的抑制表达效率,与对照(空载体)相比,SmCYP76AK5-1的RNAi转基因株系表达降低35.00%,SmCYP76AK5-2的RNAi转基因株系表达降低63.00%;进一步对转基因毛状根进行超高效液相色谱检测,以观察其丹参酮类化合物含量的变化,结果显示,RNAi转基因毛状根株系4种丹参酮类化合物含量相对PK对照毛状根株系均有不同程度降低;最后对转基因毛状根进行UPLC-MS/MS代谢组学检测,共检测到24种丹参酮类化合物,其中有2种丹参酮类化合物含量升高,其余22种丹参酮类化合物的含量积累变少,6种化合物的含量显著降低(差异倍数<0.5),其中丹参新酮(Miltirone)降低最多,为对照组的0.2倍。3.本研究探索CRISPR/Cas9基因组编辑技术在丹参CYP450s功能中的应用,在丹参体内敲除SmCYP76AK5基因。从DNA检测结果分析,转基因毛状根株系在29 bp-31 bp处缺失“GCT”三个碱基,测序峰图出现套峰,造成移码突变;而野生型序列中并没有碱基缺失和套峰出现。同时,统计基因编辑的效率发现67个单克隆中有40个在29 bp-31 bp处缺失“GCT”三个碱基,2个序列没有变化,剩余25个单克隆样品序列在sgRNA1靶序列处均有不同程度缺失或增加,成功敲除该基因,为CYP76AK5的催化底物的鉴定及蛋白功能分子机制研究奠定基础。