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研究目的作为最常见的关节的退化性疾病，骨关节炎（Osteoarthritis, OA）的病因仍然未明，其主要特征是关节软骨组织的退化、软骨细胞的凋亡。虽然已知ROS是介导软骨细胞代谢紊乱和凋亡的主要因素之一，但是其详细机制至今仍未清楚。本研究的目的在于探索H2O2介导的兔关节软骨细胞凋亡的分子机制。研究方法（1）用机械分离法从新西兰兔（6周龄）关节软骨组织（肩关节、髋关节、膝关节）中提取正常的关节软骨细胞进行原代培养。（2）分别应用不同浓度的过氧化氢（H2O2）处理兔软骨细胞，并采用CCK8法在酶标仪上检测细胞活力，以筛选出合适的H2O2浓度（0.3mM）和作用时间（30min）。（3）判断细胞死亡形式：用Annexin V/PI双染法进行流式检测，以判断H2O2引起软骨细胞的死亡形式是否是细胞凋亡。（4）分别应用流式细胞仪（荧光染色）以及共聚焦显微镜（荧光染色、质粒转染）检测H2O2诱导的软骨细胞中线粒体膜电位下降的情况。（5）共聚焦荧光显像观测溶酶体膜通透性改变。（6）酶标仪测OD值（荧光底物法）检测H2O2预处理后caspase激活情况。（7）应用Fret技术实时监测caspase-9的活化。（8）共聚焦荧光显像检测软骨细胞中Bax和BID的转位情况。（9）Western Blotting检测软骨细胞中caspase-3，-8，-9，Cyt.c，AIF以及FasL的表达情况。研究结果（1）不同浓度H2O2可以诱导软骨细胞呈浓度依赖性活力下降，而H2O2处理30min即有软骨细胞活性的明显下降，0.5mM及0.5h被选择为后续实验的药物浓度及作用时间。（2）Annexin V/PI双染法Hoechst33258染色与证明H2O2诱导软骨细胞死亡的具体方式为细胞凋亡，而NAC（清除ROS作用）可以明显保护软骨细胞免受H2O2的损伤。（3）H2O2能明显降低软骨细胞线粒体膜电位，共聚焦显微镜实时监测单个活软骨细胞显示：30min软骨细胞线粒体丝状结构即出现明显破坏，膜电位随时间进行性下降。（4）H2O2诱导的软骨细胞凋亡模型中，溶酶体膜电位及形态学无改变，提示在此软骨细胞凋亡模型中，细胞内的溶酶体并未参与诱导软骨细胞凋亡。（5）H2O2诱导软骨细胞中caspase-3和-8的大量活化，而caspase-9没有活化，caspase广谱抑制剂，caspase-3和-8抑制剂能明显抑制H2O2诱导的软骨细胞凋亡，而caspase-9抑制剂不能有效保护软骨细胞。（6）H2O2处理后软骨细胞中Bax和Bid没有从胞浆转位到线粒体上。（7）AIF在H2O2诱导的软骨细胞凋亡过程中从线粒体释放出来，而Cyt.c没有释放。（8）H2O2明显上调软骨细胞中FasL的表达量。结论H2O2通过外源性和AIF介导的caspase非依赖性的内源性凋亡通路诱导兔关节软骨细胞凋亡。