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目的:流行性感冒(influenza),是一种高度急性的上呼吸道传染性疾病,对人类健康具有巨大的威胁。H7N9,是一种新型重组的禽流感病毒亚型,其传播会致人死亡。它对鸟类的致病性较低,但却是人类高致病性病原体,这使得它很难被预测和追踪,也很难控制病毒的传播。因此,寻找一种超灵敏的方法检测H7N9流感病毒,对快速评估和控制其爆发具有非常重要的临床意义和流行病学意义。由于目前检测H7N9的方法操作繁琐,成本较高,并且灵敏度较低。因此,本研究的目的在于,引入四倍信号放大体系,构建了一种超灵敏电化学免疫传感器用于检测流感病毒亚型H7N9-HA。方法:纳米复合物Ab2/MWCNTs/S0/{S1+S2+hemin}n的构建:首先,在羧基化的多壁碳纳米管(MWCNTS)上结合H7N9多克隆抗体(Ab2)及引发链(S0),然后加入反应链(S1,S2)发生链杂交反应。接着加入过量的血红素(hemin),与上述杂交的双链形成血红素/G-四联体DNA酶串联体。最后加入亚甲蓝(MB),使其嵌入双链的沟槽中,即得到Ab2/MWCNTs/S0/{S1+S2+hemin}n纳米复合物。电极表面修饰:依次将石墨烯,金纳米颗粒,乙醇脱氢酶复合物,金纳米颗粒,蛋白a和h7n9鼠单克隆抗体ab1修饰在电极表面。电化学免疫传感器的构建及信号检测:基于双抗体夹心法,纳米复合物ab2/mwcnts/s0/{s1+s2+hemin}n结合在已修饰的玻碳电极表面,成功构建基于四倍信号放大体系(石墨烯,乙醇脱氢酶,链杂交反应,dna酶)的免疫传感器。然后在含有0.5mnad+和0.1m乙醇的pbs(0.1m,ph7.0)溶液中检测h7n9-ha抗原,得到dpv检测信号,绘制标准曲线。传感器性能评价:可行性、线性范围、最低检测限、特异性、重现性、稳定性和临床应用的潜力。结果:成功合成纳米复合物ab2/mwcnts/s0/{s1+s2+hemin}n,通过原子力显微镜证实ab2、dna和hemin成功结合到mwcnts。电极表面修饰的形态表征:扫描电镜观察到电极表面修饰的石墨烯,金纳米颗粒和乙醇脱氢酶复合体形态;x射线光电子能谱分析了乙醇脱氢酶复合体和金纳米颗粒的元素成分;循环伏安法和电阻抗法验证了电极层层修饰的步骤,共同表明免疫传感器的的成功构建。免疫传感器检测:所制备的免疫传感器,在最优的条件下检测h7n9-ha抗原,在0.008-0.06ng/ml的范围内,信号与目标物浓度呈线性相关,r2=0.9965,最低检测限为0.81pg/ml(s/n=3),线性方程为i(μa)=0.2125[c]+7.1330。各项性能评价:制备的免疫传感器表现出很好的选择性、特异性和稳定性。结论:本研究制备的电化学免疫传感器应用纳米材料增大电极表面积,提高电子传递能力等优良的性能,结合三种酶催化放大系统,以及蛋白A方向性固定抗体,超灵敏、特异的检测H7N9-HA抗原。线性检测范围为0.008-0.06 ng/mL,最低检测限是0.81 pg/mL。本方案具有一定的通用性,当改变相应的抗原抗体,形成不同的双抗体夹心体系,就可以对其它重要的生物标志物进行检测分析。构建的免疫传感器具有高灵敏度和良好的特异性,因此在床旁检测中具有巨大的应用潜力。