论文部分内容阅读
目的：
疟疾(malaria)是世界上危害最严重的寄生虫病之一,在全世界人群中具有很高的发病率和致死率,全球受疟疾威胁的人口超过30亿。疟原虫(Pjasmodium)是引起疟疾的病原体,是一类单细胞、寄生性的原生动物。在大多数疟疾流行区,由于抗药性虫株和耐药性蚊媒的不断产生和扩散,使得疟疾防治难度不断加大。因而,迫切需要研制出有效的疟疾疫苗。疟原虫生活史复杂,不同阶段引发免疫反应的抗原也不同。此外还有种株的差异以及疟原虫自身的免疫逃避等原因,给疟疾疫苗的研制带来了重重困难。目前在研究中的大多数疫苗都只是针对疟原虫的红内期或蚊体阶段,不能全面地控制疟疾。疟原虫的基因比细菌病毒的基因大得多,其候选抗原也多,但很多抗原所产生的免疫保护性不强。仅恶性疟原虫的抗原就有5300多种,但在已鉴定的约40个疫苗候选抗原中能产生强而持久的保护性免疫反应的抗原却十分有限。
针对目前疟疾疫苗研制中存在的这些问题,本实验以约氏疟原虫编码红外期肝阶段的SLARP基因为抗原基因,构建pcDNA3.1(+)-SLARP真核表达载体,观察该载体能否在真核细胞中表达及其对动物的免疫效果。以期筛选出一种有效的疟疾疫苗候选抗原,为进一步开发阻断疟疾感染的核酸疫苗奠定基础。
方法：
一、构建poDNA3.1(+)-SLARP真核表达载体
设计一对引物,以pGEX6p-1-SLARP质粒为模板,PCR扩增SLARP片段并回收。用限制性内切酶BamHⅠ/XhoⅠ双酶切扩增的目的片段及pcDNA3.1(+)载体,回收后用T4连接酶将二者连接,构建成pcDNA3.1(+)-SLARP真核表达载体。HandⅢ/PstⅠ双酶切构建的载体电泳鉴定并进行测序分析。
二、pcDNA3.1(+)-SLARP表达载体在真核细胞中的瞬时表达
将构建的真核表达载体转染真核细胞COS7,培养48小时后间接免疫荧光检测其在真核细胞中的表达情况。
三、SLARP基因真核表达载体在动物体内免疫活性的检测
(一)动物免疫
BALB/c纯系雌性小白鼠51只,随机分为三组,每组各17只,分别命名为pcDNA3.1(+)-SLARP组、pcDNA3.1(+)空载体对照组、PBS对照组。免疫前在小鼠左后肢股四头肌注射盐酸利多卡因0.25mg/只。三天后同一部位分别注射pcDNA3.1(+)-SLARP质粒、pcDNA3.1(+)空载体、PBS。每三周加强免疫一次,共免疫三次。
(二)血清特异性抗体及细胞因子的检测
每次免疫后两周,收集各组小鼠的血清及脾细胞培养上清。用ELISA法检测各组血清中特异性IgG抗体及其亚类IgG1、IgG2a、IgG2b水平,检测脾细胞培养上清液中细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。
四、统计学分析
各组数据以均数±标准差(-x±SD)表示,采用SPSS16.0统计软件对实验数据进行分析,组间比较采用Mann-WhitneyU检验,P＜0.05表示差异有统计学意义。
结果：
一、pcDNA3.1(+)-SLARP重组载体的鉴定
所得的重组载体经HandⅢ/PstⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳,获得两条大小约为4003bp和1915bp的条带,与预期结果一致。测序分析所得结果与Genebank中SLARP基因序列比对,同源性达100%。
二、pcDNA3.1(+)-SLARP表达载体在真核细胞中的瞬时表达
将构建的载体转染COS7细胞后,可在细胞浆中观察到绿色荧光,对照组则无绿色荧光。说明该重组质粒能在真核细胞COS7中正常表达。
三、SLARP基因真核表达载体在动物体内免疫活性的检测
ELISA结果显示,SLARP基因真核表达载体免疫组的小鼠产生的IgG抗体及其亚类IgGl、IgG2a、IgG2b水平明显升高,细胞因子IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平明同样升高明显,均高于两对照组(P＜0.05),差异有统计学意义。
结论：
1.成功构建了约氏疟原虫SLARP基因真核表达载体。
2.动物免疫试验表明SLARP基因重组载体能诱导体液免疫和细胞免疫,具有良好的免疫活性。