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目的：本课题运用分子生物学方法,研究ABCA1基因表达增高和降低后哺乳动物细胞株抗砷性的变化,同时观察细胞内砷含量的变化,从而确定ABCA1基因的抗砷功能,并推测其可能的抗砷机制。
方法：在Lipofectamine 2000转染剂的介导下,将含有ABCA1基因的真核表达载体转染入HeLa细胞,实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法检测转染后目的基因mRNA水平：用蛋白质免疫印记法(Western-blot)检测转染后ABCA1蛋白水平的改变,从而确定转染效率,通过噻唑兰法(MTT)检测48h急性砷染毒后光密度值(OD)值计算生存率及半数抑制浓度(IC50),分析细胞抗砷性的变化,然后运用原子荧光分光光度法(AFS)检测细胞内砷蓄积量的变化。同时,利用RNA干扰技术将ABCA1的小分子干扰RNA(siRNA)转染入抗砷细胞ECV-304中,Western-blot检测干扰后ABCA1蛋白水平的改变,确定干扰效率,然后通过噻唑兰法检测48h急性砷染毒后OD值计算生存率及IC50,分析细胞抗砷性的变化。
结果：转染48h后的real-time PCR结果显示所有标本的管家基因GAPDH和ABCA1均可见较标准的扩增曲线,无非特异扩增。各组ABCA1及GAPDH Ct值比较结果显示,转染重组质粒pcDNA3.1/ABCA1在HeLa胞中ABCA1的表达量是转染空质粒pcDNA3.1/V5-His组的22.6倍,转染空质粒pcDNA3.1/V5-His组与未转染的HeLa细胞ABCA1表达量无明显差异；Western-blot结果显示重组质粒组、空质粒组及未转染组在254 KD处均有特异性蛋白条带,其大小与ABCA1蛋白大小相符,且重组质粒组蛋白表达量明显高于转染空载体组及未转染组。这说明pcDNA3.1/ABCA1重组质粒已转入HeLa细胞并使ABCA1蛋白在HeLa细胞中呈高表达状态。转染后急性砷染毒48h用噻唑兰法计算生存率及IC50,结果显示实验组细胞在各种砷浓度下生存率均高于同步对照组细胞,两组生存率差异有统计学意义。实验组IC50为36.740μmol/l高于对照组IC50为20.721μmol/l。原子荧光分光光度法结果显示,ABCA1蛋白高表达后,HeLa细胞内砷含量在各时间段均低于对照组细胞,且4小时候后细胞内砷蓄积量趋于稳定,而对照组细胞内砷蓄积量持续增加。抗砷细胞ECV-304经siRNA干扰后,实验组ABCA1蛋白表达量明显低于阴性对照组,呈低表达状态,干扰后急性砷染毒48h,结果显示实验组细胞在各种砷浓度下生存率均低于同步对照组细胞,两组生存率差异有统计学意义。实验组IC50为7.640μmol/l低于对照组IC50为14.520μmol/l。
结论:ABCA1基因在HeLa细胞中高表达后,细胞内砷的蓄积量在短时间即达平衡,不再增加,对砷敏感的HeLa细胞对砷毒表现出耐受性,ABCA1基因在细胞中低表达后,抗砷细胞株的抗砷性明显降低,综合实验结果,进一步明确了ABCA1基因可能是抗砷的关键基因。