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研究目的探讨硒和硒蛋白H（SelH）减缓谷氨酸导致的神经细胞损伤的作用，及其保护作用与线粒体通路的关系，为神经损伤的防治提供新的思路。研究方法本实验利用体外培养的海马神经细胞（HT-22）及SelH转染的海马神经元细胞(SelH）及相应空载体转染的细胞（HT+V)进行实验。待细胞处于对数期生长时，为探讨硒对海马细胞的保护作用，HT22细胞分为以下组：①对照组；②谷氨酸组：6mM谷氨酸损伤HT-22细胞；③亚硒酸钠组：6mM谷氨酸损伤同时+100nM亚硒酸钠共同孵育。为探讨SelH对减缓谷氨酸对海马细胞的损伤作用，分为以下组：①SelH对照组：培养的SelH转染的HT22细胞不做特殊处理；②SelH谷氨酸组：4mM谷氨酸损伤selH转染细胞；③HT+V对照组：空载体转染的HT22细胞不做特殊处理；④HT+V谷氨酸组：4mM谷氨酸处理培养的HT+V细胞。 MTT法检测细胞损伤后6、10和24h的抑制率，倒置显微镜及电镜观察细胞大体及细微结构的变化；DHE探针染色观察ROS生成情况；MitoTracker Green标记线粒体，LysoTracker Red标记溶酶体，通过共聚焦显微镜观察自噬形成过程；免疫荧光化学和western-blotting法检测线粒体通路凋亡相关因子caspase-9、caspase-3及Apaf-1在不同处理组细胞中的表达。研究结果第一部分：①6mM的谷氨酸可使得培养的HT-22细胞在6h时出现8.71%±0.009抑制率，随着时间的增加，培养的细胞抑制率逐渐增加，但是亚硒酸钠组抑制率显著下降（P<0.05）。②对照组HT-22细胞形态正常，胞膜、胞核完整，细胞器丰富；细胞内可见双层胞核完整，线粒体嵴清晰，胞质内有发达的粗面内质网，内质网形态正常、颗粒分布均匀完整；而谷氨酸组可见凋亡细胞增多，凋亡细胞胞核不完整甚至消失，胞核碎裂，细胞器明显减少；细胞内双层胞核模糊不清，线粒体结构破坏，轮廓不辨甚至消失。胞浆内出现大量溶酶体，大量粗面内质网高度扩张、颗粒不完整。大量细胞胞核消失，核仁崩解碎裂，细胞器稀少，内质网高度肿胀，在胞内形成大空泡结构。亚硒酸钠组细胞相较损伤组损伤明显减少。③ROS特异性标记探针DHE标记结果提示,对照组几乎不产生ROS，而谷氨酸组中ROS产生明显增加，使用亚硒酸钠干预后ROS产生明显减轻（P<0.05）。④线粒体特异性标记探针Mito Tracker Green、溶酶体特异性标记探针LysoTracker red对各处理条件下的细胞进行双重标记观察到对照组线粒体绿色荧光染料着色清晰，轮廓清楚，溶酶体几乎不着色，而谷氨酸组中线粒体的染色明显减少，溶酶体染色明显加强（P<0.05），提示：自噬小体的发生增加。在亚硒酸钠组，自噬现象得到明显改善。⑤免疫荧光化学和western-blotting检测结果表明：与损伤组比较，亚硒酸钠组线粒体依赖的凋亡途径关键因子caspase-3、9及Apaf-1的表达是明显下降的（P<0.05）。第二部分：①MTT结果证明，4mM谷氨酸作用6h后，培养的HT+V、SelH开始被抑制，随着谷氨酸损伤时间的延长(10h和24h)，培养的HT22细胞抑制率也逐渐增加，SelH转染的细胞抑制率明显低于空载体转染的HT22细胞（P<0.05）。②对照组的SelH和HT+V组细胞形态正常，胞膜、胞核完整，细胞器丰富；细胞内可见双层胞核完整，线粒体嵴清晰，胞质内有发达的粗面内质网，内质网形态正常、颗粒分布均匀完整；谷氨酸损伤后，SelH和HT+V组均可见凋亡细胞增多，凋亡细胞胞核不完整甚至消失，胞核碎裂，细胞器明显减少；细胞内双层胞核模糊不清，线粒体结构破坏，轮廓不辨甚至消失。胞浆内出现大量溶酶体，大量粗面内质网高度扩张、颗粒不完整。大量细胞胞核消失，核仁崩解碎裂，细胞器稀少，内质网高度肿胀，在胞内形成大空泡结构。与SelH谷氨酸组相比较，vector损伤组细胞凋亡细胞明显增加（P<0.05）。③DHE检测结果显示：对照组几乎不产生ROS，谷氨酸组HT22细胞ROS产生明显增加。相对HT+V组，SelH组谷氨酸损伤后ROS产生是明显较少的（P<0.05）。④线粒体及溶酶体双标观察提示：各对照组线粒体绿色荧光染料着色清晰，轮廓清楚，溶酶体几乎不着色，谷氨酸组中线粒体的染色明显减少，溶酶体的染色明显加强，自噬小体的发生增加， vetor谷氨酸组较SelH谷氨酸组自噬现象更为明显。⑤免疫荧光化学和western-blotting检测结果表明：与对照组比较，HT+V组谷氨酸组线粒体依赖的凋亡途径关键因子caspase-3、9及Apaf-1的表达是明显上升的（P<0.05）；而SelH组细胞caspase-3、9及Apaf-1的表达升高幅度较小，且多数无统计学意义。结论:（1）硒（亚硒酸钠）可以明显缓解谷氨酸对海马神经元的损伤。（2）高表达SelH可以明显缓解谷氨酸对海马神经元的损伤。（3）硒和SelH通过减少线粒体自噬，ROS产生和稳定线粒体途径发挥神经细胞保护作用。