桃PpRBD1基因特征及功能分析

来源 :河北科技师范学院 | 被引量 : 4次 | 上传用户:A5151
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桃(Prunus persica(L.) Batsch)是起源于中国的多年生落叶乔木,在世界上种植面积广泛。环境胁迫,尤其是低温影响桃的分布、品质和产量。河北省最北部是我国桃树栽培的北方极限,该地区的桃树树体在自然条件下越冬,容易遭受低温冻害。研究桃低温胁迫相关基因,对培养抗寒性强的桃树品种具有积极作用。RBD蛋白(RNA binding domain protein)是一种具有RRM(RNA recognition motif)结构域的蛋白,能够与rRNA前体结合,低温下帮助23S rRNA正确剪切,使叶绿体内翻译机制正常进行。ATP基因是编码ATP合酶组成蛋白的一类基因,参与生物体内的氧化磷酸化等途径,与抗寒相关信号的调控有关。  本研究以‘21世纪’桃为试验材料,克隆桃核编码基因ppRBD1的gDNA和cDNA序列以及4个线粒体ATP基因,并提交到NCBI数据库。对克隆的基因序列进行生物信息学分析。提取桃叶片RNA,进行ppRBD1基因的表达分析。同时构建PpRBD1::YFP瞬时表达载体,进行亚细胞定位。并将ppRBD1基因在拟南芥中超表达,进行功能分析。结果表明:  1.以‘21世纪’桃叶片DNA为模板,依据拟南芥atRBD1基因序列和桃基因数据库设计特异性引物,克隆并测序得到桃ppRBD1基因。构建‘21世纪’桃cDNA文库,克隆并测序得到该基因的cDNA序列。将基因序列提交到NCBI数据库(GenBank登录号:KY744742)。PpRBD1基因序列全长2230 bp,蛋白质编码区长度为1542 bp,编码513个氨基酸。亚细胞定位预测结果显示,该蛋白定位于叶绿体。利用SWISS-MODEL对该基因结构域进行同源建模,得到的蛋白质三维结构具有典型的β1α1β2β3α2β4三明治结构,空间上4个反向平行的β折叠按照β4β1β3β2的顺序排列。对6个桃品种的基因序列进行比较,发现该基因在品种间较保守。对14个不同物种RBD1蛋白的氨基酸序列进行比对和系统进化分析,发现RRM结构域较保守,其它区域差异较大。  2.对桃不同时期叶片进行ppRBD1基因表达分析,结果显示,成熟叶片中的表达量高于新叶,该基因可能在成熟叶片中起更大的作用。  3.在玉米原生质体中进行 ppRBD1基因编码蛋白的亚细胞定位,结果显示,该蛋白定位于叶绿体。  4.构建拟南芥超表达ppRBD1基因株系,并对不同株系进行抗寒性检测,结果显示,ppRBD1基因影响植物抗寒性。  5.以‘21世纪’桃叶片为材料,克隆了4个线粒体 ATP基因,并对这4个基因的特征进行了分析。通过同源序列比对和编码氨基酸的分析发现,桃的ATP9基因起始密码子可能发生不同于其他物种的变化。  综上所述,本研究通过分子克隆,生物信息学分析,基因表达水平分析,亚细胞定位以及超表达株系构建等分子生物学手段,鉴定出 ppRBD1基因具有RRM保守结构域,主要在成熟叶片中发挥作用,定位于叶绿体,该基因的表达能够提高植物的抗寒性。4个ATP基因是编码线粒体ATP合酶的4个亚基。本研究为桃抗寒性分子机制的深入研究提供了理论基础。
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