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目的：胰腺癌是一种高度恶性的消化道肿瘤,近年来其发病率国内外均有明显升高的趋势。在欧美胰腺癌死亡率在所有的恶性肿瘤中居第五位,在消化道癌中胰腺癌的发病率和死亡率仅次于结直肠癌,居第二位。在我国胰腺癌是死亡率第6位的常见恶性肿瘤。胰腺癌恶性程度高,起病隐匿,不易早期发现,临床诊断病例时多为中晚期,患者预后差,术后5年生存率低,迄今无论是早期诊断还是治疗均是最困难的恶性肿瘤之一。目前研究认为,胰腺癌的发生和发展是一个多基因参与、多阶段发展的过程,它与众多基因的表达及相互作用有关,而这些基因的表达是决定胰腺癌表型多样性的分子基础。因此从基因水平研究胰腺癌的发生发展机理,并选择胰腺癌特异性基因进行早期诊断和基因治疗已成为这一领域的研究热点。基因芯片技术是近年来新兴的一项生物技术,它是利用芯片技术中信息集成化和平行处理化原理,收集成千上万个特定的寡核苷酸或DNA片段有序地高密度地排列在特定载体上,通过碱基互补配对原理进行杂交。利用基因芯片可以进行高通量的生物信息处理,确定肿瘤细胞的基因表达谱,寻找新的肿瘤相关基因及关键性调控基因,以及应用于肿瘤的基因诊断。本研究就是通过基因芯片技术筛选出胰腺癌表达差异的基因:对表达显著差异的‘TBX2进行基因和蛋白水平的检测;分析TBX2表达情况与胰腺癌临床病理特征的关系;探讨TBX2基因在胰腺癌中所参与的信号通路。
材料和方法：
1、应用基因芯片技术检测胰腺癌及癌旁正常组织中基因变化情况。
方法:取组织标本,提取总RNA,cDNA合成,标记及纯化,芯片杂交及洗脱,芯片检测。
2、对表达显著差异的候选基因,通过生物信息学查阅各基因的研究现状,进一步挖掘潜在的生物信息,筛选出胰腺癌下一步研究的目的基因。rBX2。
3、采用RT-PCR方法,检测胰腺癌和癌旁正常组织中表达显著差异的目的基因TBX2的mRNA变化情况。方法:取组织标本,提取总RNA,扩增目的基因,观察TBX2在mRNA水平的变化情况。
4、采用Western blot方法,检测胰腺癌和癌旁正常组织中表达显著差异的目的基因TBX2的蛋白表达情况。方法:提取蛋白,SDS-PAGE电泳,转膜,免疫反应,观察TBX2在蛋白水平的表达变化。
5、采用免疫组织化学ABC法检测胰腺癌和癌旁正常组织中TBX2的表达程度,分析其与胰腺癌发生部位、肿瘤大小、病理分化、肿瘤转移、临床分期、患者年龄及性别等临床病理特征之间的关系。
6、用Janus激酶抑制剂AG490阻断胰腺癌细胞株AsPC-1的STAT3信号通路,应用实时定量PCR方法检测TBX2基因与STAT3通路之间的关系。
方法:细胞培养,提取RNA,cDNA的合成,荧光实时定量PCR来观察TBX2基因与STAT3基因的变化情况。
结果：
1、胰腺癌基因表达谱芯片显示各克隆点点样均匀,杂交信号稳定,按基因芯片差异显著阳性标准,筛选出胰腺癌组织中差异表达(Ratio值＞2或＜0.5)基因155种,其中表达上调的92种,表达下调63种,涉及到细胞周期调控基因、癌基因与抑癌基因、肿瘤细胞凋亡基因、转录因子及调控基因、细胞生长和分化基因、信号转导基因、细胞骨架和细胞粘附基因等多种基因类型的改变。其中Ratio值＞3和＜0.333倍差异表达的基因12种,结合生物信息学检索,对显著差异表达基因的研究现状进行逐一分析,筛选出胰腺癌进一步研究的目的基因TBX2。
2、采用RT-PCR方法检测胰腺癌与癌旁正常组织中TBX2基因mRNA的水平,采用Western blot方法检测胰腺癌与癌旁正常组织中TBX2基因蛋白的表达情况。研究结果表明,在胰腺癌组织中TBX2的mRNA和蛋白表达均较癌旁正常组织有明显增加(P＜0.05)。一方面验证了前面基因芯片筛选结果的可靠性,另一方面为下面胰腺癌临床病理关系的研究提供实验基础。
3、通过免疫组织化学染色ABC法,有29例(60.4％)胰腺癌标本可见免疫组化染色呈强表达,而在正常胰腺标本中没有发现强表达的免疫组化染色。TBX2在胰腺癌组织中强表达例数明显高于正常胰腺标本。通过。TBX2与胰腺癌临床病理特征关系的观察发现,已发生转移的胰腺癌病例TBX2表达高于没有转移的病例,提示TBX2的表达与胰腺癌的转移密切相关。存低分化肿瘤中TBX2表达明显高于中高分化肿瘤,提示TBX2表达与肿瘤分化程度相关。在TNM分期中胰腺癌晚期病例TBX2的表达较中早期病例更为显著。而TBX2表达变化在患者年龄、性别、肿瘤直径和发生位置等方面无统计学差异。
4、实时定量PCR实验表明AG490可以明显抑制胰腺癌细胞株.AsPC-1中STAT3和TBX2 mRNA的水平。AG490作用于AsPC-1细胞48小时后,抑制剂浓度为5μmol/L组的STAT3和TBX2的mRNA相对变化略低于对照组;抑制剂浓度为10μmol/L组的STAT3和TBX2的mRNA相对变化明显低于对照组(P＜0.05);抑制剂浓度为20μmol/L组的STAT3和TBX2的mRNA相对变化更低于对照组(P＜0.01),经过双变量相关分析证实STAT3与TBX2两者呈正相关。
结论：
1、通过基因芯片技术检测发现,并应用RT-PCR、Western blot方法验证TBX2在胰腺癌组织中存在高表达,TBX2在胰腺癌发生发展中很可能具有重要作用。
2、TBX2表达变化与胰腺癌病理分化、肿瘤转移、临床分期相关,增高的TBX2表达能够反映组织表型变化和病程进展情况,有助于胰腺癌诊断和预后的判断。
3、TBX2可能通过STAT3信号通路参与了胰腺癌的发生发展,为胰腺癌基因治疗提供新的靶点。