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海洋是一个巨大的生物资源宝库。海洋生物研究已成为当前生命学科的热点课题,建立海洋生物化学指纹谱库也己被提上了日程。本课题利用本实验室与北京大学海洋天然药物及仿生药物国家重点实验室合作的契机,依据核磁共振实验室自身的技术特点,并将代谢物指纹识别的理念和方法引入对海绵和珊瑚的分析,开展海绵和珊瑚NMR指纹谱的研究,以期为相关学科研究提供和积累原始的化学信息。主要研究工作内容包括:样品制备、NMR谱的获取与处理、谱图识别与多变量分析等。 样品制备的研究是该工作的一个重要组成部分,是完成后续分析工作的基本,并决定了本工作实验结果的实际应用价值。本工作依据海洋动物的特殊性,制定了基于海绵和珊瑚样本的次生代谢化合物的提取/分离方法。所制定的方法不仅要保证样品中次生代谢产物的主体特性(排出大分子代谢成分和海洋样品中的盐分),而且要满足指纹分析对样品的要求。通过对提取条件的选择和调制,最终建立了一种规范化的海洋动物化学指纹分析的样品制备方法,并利用所建立的方法获得了54种海绵和珊瑚样本的化学测试样品。实验结果表明,所建立的样品预处理方法简单稳定,所得到的测试样品可满足1H NMR指纹实验的要求。 本工作采用lD-NOESY预饱和压水峰实验获取了54种海绵和珊瑚样本的总提物的1H-NMR谱。通过谱峰指认与文献对比显示所获取的图谱化学信息完整、特征信号清晰、己具备指纹谱的基本特征。海绵和珊瑚中所含化合物种类繁多,含量差异较大,而作为一种非选择性的测试方法,核磁共振获取的1H NMR谱信息丰富,但也存在着谱峰重叠严重,这无疑增加了信号指认和分析的难度。为此本工作中提出了根据化合物极性间的差异,采用不同极性溶剂对总提物进行进一步的规范化分离,分别获得了以上样本的乙酸乙酯、正丁醇和水提取样品216个,并采用相同的NMR实验方法获取了所有样品的1H NMR谱。谱图间的比对分析结果表明,这类谱图同样具备了指纹谱特征(本文中称为二级指纹谱),但与总提物指纹谱(本文中称为一级指纹谱)比较,谱图明显简化,更有利于谱图的指认和分析。 生物代谢产物的NMR指纹谱谱图复杂,分析难度很大,常规分析方法很难对所获得的指纹数据进行有效评估。本工作将代谢组学中指纹识别所通常采用的多变量分析方法引入,利用PLS多变量分析能力,对所建立的指纹谱的质量进行评定。结果表明:总提物NMR谱能够准确反映出样本种类、样本采集地域间的差异,满足指纹谱的基本要求;极性提取物NMR谱保留一级指纹谱分类特性也满足了指纹谱的基本要求。同时所建立的化学计量学方法可以有效地用于复杂指纹谱的识别。 本工作从海绵和珊瑚提取分离得到的216个天然产物样本已经收入海洋生物样品库。所获取的NMR谱图亦作为指纹谱收录到了海洋天然产物化学信息库,该系列谱图将为海洋天然产物化学的研究提供指导性信息,并为海洋环境、海洋生物等学科的科学研究积累相关的本底化学信息。以上工作作为国家科技重大专项课题(2009zx09501)“天然(海洋)活性产物分离及分析关键技术”的部分内容通过了国家验收。