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研究目的静脉血栓形成(Venous Thrombosis)导致的静脉血栓栓塞症(Venous Thrombus Embolism,VTE)是一种严重地威胁人类生命健康的疾病,目前没有理想的治疗药物,主要原因之一是静脉血栓的发生和发展机制仍不清楚。近几年,蛋白二硫键异构酶(Protein Disulfide Isomerase,PDI)家族在调控血栓形成中的作用日益受到关注,PDI家族的不同成员分别在内皮细胞活化,血小板聚集,白细胞募集,凝血系统激活以及纤维蛋白沉积等过程中发挥着重要作用,这为认识静脉血栓形成过程提供了新的研究思路。ERp72是PDI家族的重要成员,它含有三个PDI家族高度保守的同源序列,广泛表达于血小板,白细胞和内皮细胞。本研究建立了ERp72组织特异性敲除小鼠,并制备了重组ERp72蛋白和抑制型抗ERp72单克隆抗体,通过观察ERp72的缺陷和活性抑制在小鼠静脉血栓模型中的表型,认识ERp72在静脉血栓形成中的作用,并初步探讨其作用机制。研究方法1.构建ERp72-loxp(ERp72fl/fl)小鼠,将ERp72fl/fl小鼠和Pf4-cre、Tie2-cre小鼠交配,获得Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠(血小板ERp72特异性敲除小鼠)和Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠(内皮及造血系ERp72特异性敲除小鼠)。通过基因组PCR鉴定小鼠基因型;通过Western blot鉴定小鼠血小板、白细胞及内皮细胞中ERp72表达水平。2.获取Tie2-cre/ERp72fl/fl和Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠及其对照小鼠全血,进行血细胞计数。分离Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠及对照小鼠血浆,检测血浆凝血酶原时间(Prothrombin Time,PT)和活化部分凝血活酶时间(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)。3.使用Tie2-cre/ERp72fl/fl和Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠及其对照小鼠,建立小鼠下腔静脉狭窄血栓模型,48小时后,取下腔静脉血栓称重并统计。使用C57BL/6小鼠建立小鼠下腔静脉狭窄模型,并从尾静脉注射250?g重组无酶活性ERp72蛋白(erp72oo-oo-oo)或等体积对照溶液,48小时后,取下腔静脉血栓称重并统计。4.将tie2-cre/erp72fl/fl小鼠及对照小鼠下腔静脉狭窄6小时后,从狭窄处近心端采血400?l,应用elisa检测血浆血管性血友病因子(vonwillebrandfactor,vwf)水平。5.从pf4-cre/erp72fl/fl小鼠及对照小鼠全血中分离血小板,使用thrombin或convulxin刺激,检测血小板聚集功能。6.将人外周血单个核细胞(peripheralbloodmonocuclearcell,pbmc)分别与erp72单克隆抗体或同型对照igg预孵育,100ng/ml脂多糖(lps)刺激4小时上调组织因子(tissuefactor,tf)表达,应用凝血酶生成分析(thrombingenerationassay,tga)检测两组pbmc的凝血酶生成能力。使用负筛选方法分选tie2-cre/erp72fl/fl小鼠及对照小鼠骨髓单核细胞,100ng/mllps刺激4小时后,流式检测tf表达水平。7.将重组野生型erp72蛋白(erp72ss-ss-ss)与凝血因子fxii(fxii)37℃孵育1小时,加巯基标记剂mbp室温孵育15分钟,通过非还原条件sds-page电泳和免疫印迹,检测fxii自由巯基变化。实验结果1.pcr结果表明erp72fl/fl小鼠的erp72基因成功插入loxp位点,pf4-cre/erp72fl/fl小鼠和tie2-cre/erp72fl/fl小鼠基因组分别成功融合pf4-cre和tie2-cre位点;western结果显示,pf4-cre/erp72fl/fl小鼠和tie2-cre/erp72fl/fl两种敲除小鼠血小板erp72均表达缺失,tie2-cre/erp72fl/fl小鼠白细胞和内皮细胞erp72表达缺失,所有这些erp72敲除细胞pdi,erp57等同源蛋白均表达正常。2.两种基因敲除小鼠的全血细胞计数与野生型小鼠相比均无差异;tie2-cre/erp72fl/fl小鼠血浆凝血酶原时间pt和活化部分凝血活酶时间aptt正常,说明erp72不参与骨髓造血功能和凝血蛋白合成。3.在小鼠下腔静脉狭窄血栓模型中,与对照野生型小鼠组相比,pf4-cre/erp72fl/fl小鼠下腔静脉中形成的血栓重量没有明显差异[20.58±2.20?g(n=8)vs16.97±1.42?g(n=12),p=0.1648],而tie2-cre/erp72fl/fl小鼠下腔静脉中形成的血栓明显减小[30.08±3.02?g(n=8)vs16.04±3.03?g(n=7),p=0.0062]。与尾静脉注射对照溶液的小鼠相比,注射重组erp72无酶活蛋白erp72oo-oo-oo的小鼠下腔静脉中形成的血栓明显减小[23.84±2.97?g(n=8)vs 12.04±2.32?g(n=8),P=0.0074]。4.在未干预情况下,ERp72fl/fl小鼠和Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠血浆vWF含量没有明显差异[95.30±11.66ng/ml(n=4)vs 91.80±15.46ng/ml(n=4),P=0.8648];下腔静脉狭窄6小时后,两组血浆vWF含量均有增加,但敲除小鼠血浆vWF含量明显低于对照组小鼠[156.9±3.42ng/ml(n=5)vs 120.2±10.32ng/ml(n=5),P=0.0188]。5.与对照小鼠血小板相比,使用thrombin或convulxin刺激的Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠血小板聚集功能明显减弱。6.与对照IgG相比,抗ERp72单克隆抗体处理的PBMC受LPS刺激后,凝血酶生成峰值明显降低[77.27±2.41nM(n=3)vs 52.43±3.87nM(n=3),P=0.0055]。经过LPS刺激后,与ERp72fl/fl小鼠骨髓单核细胞相比,Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠骨髓单核细胞表面TF表达明显减少。7.自由巯基标记实验结果显示,重组野生型ERp72蛋白(ERp72ss-ss-ss)能显著增加FXII自由巯基水平。结论1.内皮及造血系ERp72表达缺失显著性抑制下腔静脉血栓形成。2.ERp72通过调控vWF释放,血小板聚集,单核细胞促凝活性以及FXII氧化还原状态等方面影响静脉血栓形成。