miR-leT-7a在大白猪甲状腺中的表达及其细胞凋亡影响的初步研究

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microRNA(miRNA)是一类内源性的非编码RNA,广泛参与细胞的生长发育、分化、增殖和凋亡等生物学过程。miR-let-7是一种miRNA,而miR-let-7a是miR-let-7家族的重要成员,对细胞的增殖与凋亡的调控有着重要的作用。  为了研究miR-let-7a对猪(Sus scrofa)甲状腺的生长发育及其细胞凋亡的调控作用,本研究利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测了miR-let-7a在不同生长阶段(胚龄60、80、105d和日龄25、60、90、120、150、180d)大白猪甲状腺组织中的表达量变化;利用间接免疫荧光技术对甲状腺组织中特异性表达的甲状腺球蛋白(TG)进行检测,从而鉴定了大白猪的甲状腺组织;通过组织块消化培养法对甲状腺细胞进行体外培养,观察了原代和传代甲状腺细胞的基本形态,采用间接免疫荧光法鉴定了其是否为大白猪甲状腺细胞和具有正常的功能;通过转染miR-let-7a mimics,并利用流式细胞术检测了转染组与未转染组的甲状腺细胞凋亡率,进而利用生物信息学手段预测了miR-let-7a与细胞凋亡相关基因的靶向关系,用以分析miR-let-7a调控细胞凋亡的相关路径。  结果发现,甲状腺组织和细胞中的甲状腺球蛋白(TG)发出明显的绿色荧光,表明体外培养的甲状腺细胞功能正常。qRT-PCR结果显示,胚胎期随着胚龄的增加,miR-let-7a的相对表达量逐渐增加。出生后miR-let-7a表达量下降,于60日龄达生长期最小值,之后有所上升,至90日龄后其表达量再次下降,120日龄后随日龄的增加,miR-let-7a表达量呈现逐渐增加的趋势。凋亡结果发现,和对照组相比,转染组细胞凋亡率明显升高(P<0.05)。根据研究结果推测,miR-let-7a的表达直接或间接影响了甲状腺细胞凋亡的调控过程。通过生物信息学软件预测得到了大量miR-let-7a的候选靶基因,KEGG通路分析得到了这些靶基因显著富集的16个通路以及与细胞凋亡通路中的两个候选靶基因FAS和FASL,推测在甲状腺细胞中miR-let-7a对FAS和FASL表达变化以及其介导的细胞凋亡通路可能存在一定的调控作用。
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