论文部分内容阅读
本研究隶属于国家自然科学基金面上项目《基于Nrf2/ARE信号通路的蛋清源小肽协同抗氧化作用机制研究》（31471597）。自2012年起,我国的玉米年产量已连续多年超过2亿吨,我国玉米的工业加工率在30%40%,而玉米工业加工最主要的副产物是玉米蛋白粉,因此,我国每年玉米蛋白粉的数量非常可观。虽然玉米蛋白粉的蛋白质含量在60%左右,但由于醇溶蛋白比例较大,导致玉米蛋白的水溶性差,而且玉米蛋白缺乏赖氨酸和色氨酸,限制了玉米蛋白的食用价值,因此,玉米蛋白粉的精深加工对玉米加工行业的发展非常重要。本文以玉米蛋白粉为原料,制备玉米抗氧化肽,用多种方法评价了玉米抗氧化肽的自由基清除活性、细胞内活性氧清除活性、抗氧化酶活性调节作用、抗氧化基因表达调节作用等,以及在Caco-2细胞单层膜的完整吸收和对刷状缘膜酶的稳定性。主要研究内容和结果如下:（1）利用Alcalase水解玉米蛋白粉,水解物经过超滤分离后收集分子量小于1 kDa和13 kDa的玉米蛋白水解物组分CGH1和CGH2。体外自由基清除活性实验表明,CGH1和CGH2均具有较强的自由基清除活性,包括DPPH自由基清除活性、羟自由基清除活性、超氧阴离子自由基清除活性、ABTS自由基清除活性和氧自由基吸收能力（ORAC）。另外,CGH1和CGH2还具有亚铁离子螯合能力和铁还原能力。氨基酸组成分析结果显示,CGH1和CGH2的总氨基酸含量分别为63.07 g amino acid/100 g peptide和68.78 g amino acid/100 g peptide,其中,CGH1和CGH2的Ala、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Pro和Trp等抗氧化氨基酸占总氨基酸的28.79%和28.24%。（2）在细胞抗氧化活性（CAA）实验中,玉米蛋白水解物CGH1和CGH2均能有效清除ABAP诱导产生的HepG2细胞内自由基,在有PBS清洗细胞程序的CAA实验中,CGH1和CGH2的细胞内自由基清除活性的EC50值分别为12.40±2.01 mg/m L和13.86±0.78 mg/mL,而在无PBS清洗细胞程序的CAA实验中,CGH1和CGH2的EC50值分别为2.85±0.19 mg/mL和5.05±0.32 mg/mL,CGH1的细胞内抗氧化活性强于CGH2。在H2O2诱导HepG2细胞氧化应激实验中,玉米蛋白水解物CGH1和CGH2均具有较强的细胞保护作用和细胞内活性氧清除活性。另外,玉米蛋白水解物CGH1和CGH2对H2O2诱导氧化损伤HepG2细胞内抗氧化酶SOD、CAT和GR活性、以及总GSH水平有积极的调节作用,当浓度为2.5 mg/mL时,CGH1和CGH2分别使SOD活性从氧化损伤组的86.54%增长到114.14%和109.72%,使CAT活性从氧化损伤组的71.91%增长到107.64%和106.50%,使GR活性从氧化损伤组的70.52%增长到103.01%和104.10%,使总GSH水平从氧化损伤组的81.39%增长到114.00%和108.82%。（3）利用RT-PCR Array测定了玉米蛋白水解物CGH1和CGH2对HepG2细胞内84条与氧化应激和活性氧代谢相关抗氧化基因表达的调节作用。结果显示,CGH1处理组的差异表达基因数量显著大于CGH2处理组,说明CGH1对细胞内抗氧化基因表达的调节作用强于CGH2。并且,CGH1能够促进H2O2诱导氧化应激抑制基因的表达,如GPX3、GPX5、SOD3、CYGB、SEPP1、MT3等基因在H2O2诱导氧化应激细胞中为表达下调,但在CGH1预处理细胞中为表达上调。另外,GO富集分析结果显示,差异表达基因与氧化应激和ROS代谢高度相关,且差异表达基因及其编码产物的生物功能主要集中在细胞膜上,而KEGG信号通路分析结果显示,CGH1的细胞内抗氧化作用与花生四烯酸代谢生物通路有关,CGH1能够抑制EPHX2基因的表达,从而升高细胞内花生四烯酸代谢产物环氧二十碳三烯酸（EET）的水平,而EET可以通过形成EET-磷脂修复因H2O2诱导损伤的细胞膜。（4）利用MALDI-TOF/TOF质谱鉴定得到2条玉米源抗氧化肽序列YFCLT和GLLLPH,其ABTS自由基清除活性的EC50值分别为37.63μM和41.38μM。采用Caco-2细胞单层膜模型测定玉米源抗氧化肽YFCLT和GLLLPH的吸收转运和对刷状缘膜酶的降解。结果表明,YFCLT和GLLLPH易被刷状缘膜酶尤其是DPPIV降解,降解率分别为36%和75%,该降解作用可以被DPPIV抑制剂diprotin A抑制,分别降低至29%和26%。但是,YFCLT和GLLLPH仍然能被Caco-2细胞单层膜完整吸收,表观渗透系数Papp值分别为（1.10±0.16）×10-7 cm/s和（1.98±0.23）×10-7 cm/s。另外,细胞松弛素D能显著增大YFCLT和GLLLPH的吸收率,而渥曼青霉素和叠氮化钠则显著抑制YFCLT和GLLLPH的吸收率,说明玉米源抗氧化肽YFCLT和GLLLPH在Caco-2细胞单层膜的吸收机制可能是受紧密连接调控的细胞旁路途径和能量依赖的细胞胞吞途径两种。