论文部分内容阅读
中华绒螯蟹Eriocheir sinensis(河蟹、大闸蟹),作为大众普遍接受喜爱的经济水产品,是这些年来十分具有养殖价值的经济养殖水产品,河蟹养殖是我国淡水养殖业的支柱性产业,贡献了巨大的经济产值。但跟随着养殖科学技术的进步,集约化养殖业已经称为河蟹养殖的普遍方式,随着起迅速发展的发展,由各种细菌、病毒、寄生虫所导致的病害的发生束缚了河蟹养殖业的进步、对这个行业造成经济损失十分巨大。中华绒螯蟹螺原体(Spiroplasma eriocheiris)是近年发现的能够侵染中华绒螯蟹、克氏原螯虾(Procambarus clarkii)、南美白对虾(Litopenaeus vannamei)、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)以及日本沼虾(Macrobrachium nipponensis)等水生甲壳动物的重要病原。螺原体通过鳃及体表进入中华绒螯蟹体内,随后侵染中华绒螯蟹血淋巴细胞,随后在血淋巴细胞内大量繁殖,然后通过宿主血液循环到达全身以进一步侵染肌肉和神经等组织,导致中华绒螯蟹附肢颤抖直至死亡,故称之为中华绒螯蟹“颤抖病”。由于螺原体的特殊性及致病性,研究其致病机制以及宿主的免疫防御机制显得尤为重要。侯利波博士毕业论文中螺原体刺激前后中华绒螯蟹胸神经节磷酸化蛋白组学结果显示囊泡相关蛋白(EsVAMP)以及钙调蛋白激酶Ⅱ(EsCaMKⅡ)表达量显著变化,预示这两个蛋白参与了螺原体感染中华绒螯蟹的进程,但是它们具体功能还不清楚。本研究主要针对EsVAMP和EsCaMKⅡ开展它们在螺原体感染过程中的功能研究,主要利用生物信息学分析、双链RNA干扰技术以及真核表达等技术展开研究,本论文主要包括以下三个结果:1.EsVAMP和EsCaMKⅡ的克隆、生物信息学分析以及组织分布研究利用RACE技术克隆出EsVAMP以及EsCaMKⅡ的序列全长,结果表明EsVAMP序列的全长为1681 bp,其中包含395 bp的开放阅读框(ORF)、90 bp的5’-非编码区(UTR)和1277 bp的3’-UTR。EsVAMP的蛋白序列与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、丽蝇蛹金小蜂(Nasonia vitripennis)、尾峰(Orussus abietinus)和桔小实蝇(Bactrocera dorsalis)的VAMP蛋白序列的相似性分别为96.67%、91.67%、89.69%和88.00%。q RT-PCR表明EsVAMP在河蟹血淋巴和神经组织中的表达量较高,其次是鳃组织、肠组织和肝胰腺,而在心和肌肉组织中的表达量是最低的。EsCaMKⅡ序列的全长为3314 bp,其中包括1605 bp的ORF、90bp的5’-UTR和1619 bp的3’-UTR,该基因中含有一个大小为774 bp的丝氨酸和苏氨酸蛋白激酶催化结构域(Ca MKⅡ-CD)。Es CAMKⅡ的蛋白序列与美洲大蠊(Periplaneta americana)、堆沙白蚁(Cryptotermes secundus)、湿木白蚁(Zootermopsis nevadensis)和萤火虫(Photinus pyralis)的Ca MKⅡ蛋白序列的相似性分别为83.43%、83.58%、82.87%和84.69%。q RT-PCR结果表明EsCaMKⅡ在中华绒螯蟹的血淋巴、神经、鳃以及肌肉中的表达量较高,而在肝胰腺、心和肠中的表达量很低2.EsVAMP在螺原体侵染中华绒螯蟹过程中的功能研究通过合成EsVAMP的ds RNA并注射到河蟹体内来进行干扰实验,ds RNA成功抑制了河蟹体内EsVAMP的表达后,再用螺原体侵染,结果表明血淋巴细胞中的螺原体拷贝数和中华绒螯蟹的死亡率明显升高。之后将EsVAMP和GFP真核表达载体连接后转染细胞,之后再用螺原体刺激,EsVAMP过表达组的细胞形态以及细胞活力均优于对照组,与此同时,过表达组的螺原体拷贝数也明显少于对照组。以上实验结果说明EsVAMP在帮助中华绒螯蟹抵御螺原体感染的过程中起到重要的作用。3.EsCaMKⅡ在螺原体侵染中华绒螯蟹过程中的功能研究通过合成EsCaMKⅡ的ds RNA并注射到河蟹体内来进行干扰实验,ds RNA成功抑制了河蟹体内EsCaMKⅡ的表达后,再用螺原体侵染,结果表明血淋巴细胞中的螺原体拷贝数和中华绒螯蟹的死亡率明显升高。Ca MKⅡ-CD是EsCaMKⅡ的主要结构域,将这个功能结构域和GFP真核表达载体进行连接后转染细胞,之后再用螺原体刺激,实验组的细胞形态以及细胞活力均明显优于对照组,同时过表达组的螺原体拷贝数明显少于对照组。以上实验结果说明EsCaMKⅡ在帮助中华绒螯蟹抵御螺原体感染的过程中起到重要的作用。