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研究背景胃癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率在各种癌症中均位列前五位。包括我国在内的东亚地区是胃癌的高发区,发病率高达49.2人/10万人。我国70%-90%的胃癌患者就诊时即已为进展期胃癌,并可能伴有周围侵犯或转移,单纯手术切除无法治愈,因此化疗已成为胃癌综合治疗的重要部分。目前胃癌化疗方案多以铂类、氟尿嘧啶等药物为主,但由于存在胃癌细胞耐药,严重影响了化疗的疗效及患者预后。迫切需要探究化疗耐药机制以改善药物反应。而肿瘤干细胞被视为肿瘤耐药和复发的根本。因此,深入研究肿瘤干细胞有助于减少肿瘤干性进而增强肿瘤化疗敏感性,为胃癌治疗开辟新途径。去乙酰化酶SIRT1属于Ⅲ型组蛋白去乙酰化酶,与Zn2+依赖性去乙酰化酶不同,SIRT1发挥作用需要依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide-Adenine Dinucleotide,NAD)。通过去乙酰化组蛋白或非组蛋白底物,SIRT1在代谢、自噬、免疫及肿瘤等诸多生物学过程中发挥重要作用。然而由于肿瘤的类型以及信号通路不同,SIRT1在肿瘤中的作用还存在争议。我们先前的研究发现SIRT1在胃癌组织中呈低表达。SIRT1通过抑制转录因子NF-κB,降低重要的细胞周期调节蛋白Cyclin D1的表达,诱导胃癌细胞停滞于G1期,从而抑制胃癌的发生。随后发现SIRT1可以通过与转录因子c-JUN结合,使其去乙酰化,失去转录活性,进而抑制ARHGAP5的表达,遏制胃癌的侵袭和转移。然而SIRT1在胃癌耐药和干性中的作用机制尚未阐明。研究发现,缺氧抑制了非小细胞肺癌小细胞(NSCLC)中SIRT1的表达,从而抑制了下游靶分子AMPK的激活过程,阻止线粒体凋亡,增强NSCLC细胞对顺铂和多柔比星耐药,且在体应用SIRT1激动剂能够增强肿瘤细胞的化疗敏感性。Sun等人的研究表明,去乙酰化酶SIRT1在骨髓增生异常综合征恶性增殖的造血干细胞/祖细胞中表达降低,进而抑制TET2的酶活性,促进细胞肿瘤干性的维持,使得患者对传统治疗药物抵抗。在乳腺癌中,SIRT1调控的信号通路能够抑制细胞干性重要转录因子KLF4的活性,诱导肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,遏制肿瘤的复发和转移。据此,我们对SIRT1在胃癌细胞的耐药和肿瘤干性过程中的作用展开初步研究,发现SIRT1参与了胃癌细胞耐药和肿瘤干性的调控过程,接下来将深入探究去乙酰化酶SIRT1在调节胃癌耐药和肿瘤干性中的具体作用机制。研究目的深入研究SIRT1对胃癌化疗耐药和肿瘤干性过程的调控作用及具体机制,为减少胃癌化疗耐药和复发提供理论依据和分子靶点。研究方法和结果1.SIRT1的表达下调与胃癌患者的预后不良相关。组织芯片结果表明SIRT1在胃癌组织中表达下调,Cox回归分析显示SIRT1的表达水平与胃癌患者的存活显著相关,生存分析显示SIRT1表达较高的患者总生存期较长。利用Kaplan-Meier Plotter数据库(218878_s_at)分析胃癌患者的生存期,发现高表达SIRT1的胃癌患者总生存期和首次进展生存期都较长,且在接受5-FU化疗的胃癌患者中SIRT1水平与总体存活或首次进展间隔之间也有相关性。说明SIRT1低表达与胃癌预后不良相关,同时提示SIRT1与胃癌患者的药物反应性有关。2.SIRT1抑制胃癌细胞耐药。我们利用SIRT1过表达或干扰的慢病毒稳转胃癌细胞(SGC-7901、BGC-823、AGS),MTS实验检测顺铂和5-FU的半数抑制浓度(IC50),克隆形成实验检测顺铂作用后细胞的克隆形成能力。发现SIRT1抑制的稳转细胞,顺铂和5-FU的半数抑制浓度(IC50)明显升高,顺铂作用后的细胞的克隆形成能力较对照组增强。流式细胞术和western blot检测细胞的凋亡情况,结果显示顺铂作用后,SIRT1抑制的稳转细胞,细胞凋亡的比例显著降低,凋亡相关分子Caspase-3的活性降低;过表达SIRT1则结果恰恰相反。说明SIRT1抑制胃癌细胞耐药。在裸鼠体内,分别用过表达或干扰SIRT1的稳转胃癌细胞SGC-7901及它们相应的对照稳转细胞进行裸鼠皮下成瘤实验,每种细胞均分为生理盐水对照组和顺铂治疗组,治疗20天后处死裸鼠。发现顺铂治疗能显著抑制肿瘤体积,与对照组相比,SIRT1过表达组肿瘤体积明显减小,对顺铂治疗的敏感性增强,SIRT1低表达组的结果相反。3.SIRT1抑制了胃癌细胞的肿瘤干性。利用构建好的SIRT1过表达或干扰的稳转胃癌细胞株,通过克隆球形成实验,软琼脂克隆球形成实验检测细胞的肿瘤干性,发现过表达SIRT1的胃癌细胞的克隆球形成能力明显降低,干扰SIRT1则结果相反。荧光定量PCR和流式细胞术检测经典胃癌干细胞标记物CD44和重要干性转录因子的表达,发现SIRT1过表达组CD44及干性转录因子的mRNA水平降低,CD44阳性细胞的比例也明显减少。悬浮培养的克隆球和顺铂处理后的胃癌细胞中,CD44和干性转录因子的mRNA水平增加,而SIRT1表达下调。顺铂处理后,SIRT1干扰的稳转胃癌细胞中CD44阳性的肿瘤干细胞更丰富。4.AMPK和FOX03参与了 SIRT1对胃癌细胞化疗耐药和肿瘤干性的调控。为了初步探索SIRT1调控胃癌耐药和肿瘤干性的分子机制,我们对SIRT1下游的信号分子AMPK展开分析。通过对顺铂IC50的测定和顺铂作用后细胞凋亡的检测,发现在SIRT1过表达胃癌细胞中抑制AMPKα只能部分逆转由SIRT1诱导的化疗敏感性。提示除AMPK外,还有其他靶基因参与这个过程。随后我们检测肿瘤抑制性转录因子FOX03是否参与了由SIRT1诱导的药物敏感性。结果显示在SIRT1过表达胃癌细胞中抑制FOX03a也只能部分逆转由SIRT1诱导的化疗敏感性,而双敲除AMPKα和FOX03a则能彻底逆转SIRT1诱导的胃癌细胞的化疗敏感性。我们的结果说明AMPK和FOX03均参与了 SIRT1对胃癌细胞化疗耐药的调控,并且这两种靶分子之间可能存在协同效应。与体外研究结果一致,在体裸鼠成瘤实验结果显示,使用特异性抑制剂抑制AMPK和FOX03的活性能够彻底逆转SIRT1诱导的胃癌细胞对顺铂的化疗敏感性。此外,AMPK和FOXO3参与SIRT1对肿瘤干性的调控得到了克隆球形成实验的证实。5.AMPK与FOXO3之间存在正反馈调节。免疫荧光法检测FOXO3a的亚细胞定位,发现AMPK的激动剂能够促进FOXO3a核转移,而AMPK的抑制剂作用相反。然后我们使用含有3个重复的FOXO结合元件的荧光素酶质粒检测FOXO3a的转录活性。双荧光素酶实验结果显示,AMPK的激动剂能够增强FOXO3a的转录活性,而AMPK的抑制剂则能够抑制FOXO3a的转录活性。为检测FOXO3a能否调节AMPK的表达,我们在胃癌细胞中干扰FOXO3a的表达后,发现AMPKα的mRNA水平显着下降,而AMPK的γ亚基和AMPK的β亚基mRNA水平并没有发生显著变化。此外,敲除FOXO3a后,AMPKα的蛋白和磷酸化水平明显降低,而AMPKy的蛋白水平没有显著变化。利用JASPAR数据库分析AMPKα和AMPKy的启动子序列,在AMPKα的启动子区域中预测到三个FOXO3结合位点,在AMPKγ启动子中预测到一个FOXO3结合位点。染色质免疫沉淀实验(ChIP)结果显示FOXO3在AMPKα启动子的第二个和第三个结合位点检测到明显的结合信号,而在AMPKα启动子第一个结合位点仅检测到微弱信号,在AMPKy启动子上没有检测到结合信号。为了进一步明确FOXO3与AMPKα启动子的结合是否具有功能,我们构建了包含AMPKα启动子序列及FOXO3a结合位点单突变启动子序列的荧光素酶报告载体。双荧光素酶实验显示敲除FOXO3后AMPKα启动子的荧光素酶活性降低。突变FOXO3的第一个结合位点后荧光素酶活性没有变化,突变FOXO3的第二个结合位点可基本回复FOXO3敲除导致的AMPKα启动子荧光素酶活性的降低,突变FOXO3的第三个结合位点起到部分回复作用。因此,结果表明FOXO3与AMPKα启动子上的第二个和第三个结合位点结合并发挥功能,其中第二个结合位点功能更重要。6.临床样本中SIRT1、AMPK和FOXO3的相关性。为了确定AMPKα和FOXO3a在胃癌中的临床意义,我们使用包括117对石蜡包埋的胃癌组织和匹配的癌旁组织的组织阵列评估p-AMPKα和FOXO3a的表达。免疫组织化学染色显示p-AMPKα和FOXO3a在胃癌组织中低表达。在SIRT1高表达组胃癌组织中的p-AMPKα和FOXO3a表达水平明显高于SIRT1低表达组。利用免疫组化评分,我们发现SIRT1和FOXO3a以及p-AMPKα和FOXO3a都有相关性。生存分析结果表明p-AMPKα或FOXO3a高表达的患者有较长存活时间。与我们的研究结果一致,Kaplan-Meier plotter数据库显示接受5-FU化疗的胃癌患者中,AMPKα或FOXO3a高表达者有较长存活时间和首次进展间隔。Cox回归分析也显示p-AMPKα和FOXO3a的表达水平与胃癌患者的存活显著相关。结论:SIRT1能抑制胃癌细胞的耐药和肿瘤干性。AMPK与FOXO3参与SIRT1对胃癌细胞耐药和肿瘤干性的调控过程,并且二者之间存在正反馈调节。