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一、研究背景与目的翼状胬肉是我国常见的眼表增生性疾病,表现为眼局部球结膜纤维血管组织增生并侵犯角膜,翼状胬肉侵犯角膜后逐渐增大,甚至可遮盖瞳孔区,其存在不仅影响患者的美观,还会因为翼状胬肉组织牵拉作用引起眼部不适、角膜散光,同时可能会造成患者眼球运动障碍。如果胬肉遮盖瞳孔影响光线入眼,会严重影响患者视力。目前翼状胬肉发病机制尚不明确,涉及多个学说,如细胞凋亡控制失调、氧化损伤、病毒感染、多种细胞因子的作用等。治疗上包括手术治疗、药物治疗及物理治疗,目前临床仍以手术治疗为主,但尽管手术方式不断改进,手术复发率仍较高,且手术本身易使患者产生恐惧心理。一些抗肿瘤药物如丝裂霉素、平阳霉素等主要用于术中辅助治疗,以期降低手术复发率,但这些抗肿瘤药物虽可部分降低翼状胬肉术后复发率,但同时也可能导致切口愈合时间延迟、巩膜溶解等严重的并发症,临床应用亦受到了极大的限制。近年来随着抗新生血管药物的发展,雷珠单抗、贝伐单抗亦用于翼状胬肉的治疗,但其有效性仍受到争议,短期随访药物耐受性较高,无严重并发症,但尚缺乏大规模多中心临床实验,长期并发症不详。追其根本,对翼状胬肉的病因与其发病机制认识不足是导致其缺乏有效防治措施的根本原因,因此进一步研究翼状胬肉的发病机制对其防治至关重要。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种高度保守的非典型丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,其在体内存在mTORCl(mTOR complex 1)及mTORC2两种不同复合物形式。mTORC1整合了营养、生长因子、能量和应激等一系列信号通路,进而全面调控细胞代谢、生长、增殖和存活。目前已发现人类很多重大疾病(如肿瘤、心血管疾病、糖尿病视网膜病变等)均涉及mTOR信号通路的失衡,因此近年来对该通路的研究已经成为增生性疾病靶向治疗及药物研发的焦点,但该通路与翼状胬肉的研究尚未见报道。大量流行病学与基础研究均表明翼状胬肉是一种与紫外线照射密切相关的疾病。皮肤癌是另一种与紫外线照射密切相关的疾病,最新研究表明,皮肤癌的发生正是由于紫外线刺激激活mTORC1通路的活性而使细胞凋亡与细胞增殖失衡所导致的。来自台湾的流行病学调查表明,翼状胬肉人群中皮肤癌患病率明显高于正常人群,提示翼状胬肉可能与皮肤癌存在相似的发病机制,因此我们认为翼状胬肉的发生可能与mTORCl信号通路激活导致细胞过度增殖有关。细胞周期蛋白(CyclinD1)和血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是mTORC1下游2个重要的信号传递蛋白,它们的表达均受mTORC1的正调控,且在mTORC1参与的肿瘤的形成过程发挥着重要的角色。CyclinD1是一种重要的细胞调控蛋白,目前已被证实在如乳腺癌、肺癌、胆管癌、子宫肌瘤等多种异常增生性疾病中发挥重要的作用。细胞周期分为间期和分裂期两个阶段,其中间期又分为DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期),G1/S调控点是细胞周期中最重要的调控点,其决定了细胞周期的进程。CyclinD1与细胞周期依赖激酶4和6(CDK4-6)结合形成CyclinD1/CDK4-6复合物,在G1早期发挥正性调控作用。正常情况下,CyclinD1蛋白只在G1期一过性表达,若其过度表达,可促进细胞从G1期向S期转化,加速细胞周期进程,促使细胞处于持续增殖状态。VEGF是一个非常强效的血管形成刺激因子,与组织新生血管的形成密切相关,形成的新生血管为氧气和营养物质进入组织提供基础条件。VEGF与内皮细胞受体结合后,可立即引起钙离子内流,使细胞内钙离子浓度迅速升高,并刺激三磷酸肌醇的产生。VEGF与受体胞外区域结合后,可使受体二聚体化,诱导受体胞内区的酪氨酸残基自动磷酸化和细胞内蛋白的酪氨酸磷酸化,传导胞内信号,促进血管内皮细胞增殖、增加血管的通透性,促进血浆蛋白向细胞外基质渗漏,渗漏的蛋白在细胞外基质中沉着,进而形成纤维素支架,为血管的生长和细胞的迁移提供合适的基础,最终导致新生血管的形成,促进异常增生组织的持续增长。在多种肿瘤中均存在CyclinD1和VEGF的过表达,并且在恶性肿瘤中,其表达水平与癌症的分期、分级和预后密切相关。最新研究发现在子宫内膜癌等疾病中,CyclinD1和VEGF的表达正是由于mTORC1通路来调控的。翼状胬肉组织呈不断生长状态,并逐渐侵入角膜组织,病理学表现为大量成纤维细胞的增殖,伴有新生血管的形成和炎症细胞的浸润,这与肿瘤组织的生长方式非常相似。现已发现CyclinD1和VEGF在翼状胬肉中均呈高表达状态,分别抑制CyclinD1或VEGF的表达水平,可使翼状胬肉上皮细胞和成纤维细胞的生长受到明显抑制,但关于mTORC1通路在翼状胬肉中的作用,及mTORC1通路在翼状胬肉中是否参与CyclinD1和VEGF的表达调控目前仍不清楚。本研究旨在通过检测mTORC蛋白及mTORC1通路下游蛋白P-S6表达水平,在国内外率先揭示mTORC1通路在原发性翼状胬肉中呈激活状态。并检测CyclinD1与VEGF在原发性翼状胬肉中的表达水平,分析P-S6与CyclinD1、VEGF的表达关系,探讨mTORC1信号通路在翼状胬肉发病机制中的作用,为寻找翼状胬肉的有效治疗药物提供基础。二、研究方法本研究收集2013年5月至2014年7月在南方医科大学第三附属医院眼科确诊为原发性翼状胬肉行手术治疗患者共31例,正常结膜组织取自原发性孔源性视网膜脱离手术患者13例,斜视手术患者4例。25例翼状胬肉组织和11例正常结膜组织置于4%多聚甲醛溶液中固定,并行石蜡包埋、切片;6例原发性翼状胬肉组织和6例正常结膜组织放入液氮中保存,并应用以上组织进行下列实验研究:1、应用苏木精-伊红染色观察原发性翼状胬肉组织与人正常球结膜组织的组织学表现差异;2、利用免疫组织荧光染色检测原发性翼状胬肉组织和人正常球结膜组织中mTOR、P-S6蛋白的表达水平;3、利用免疫印迹法(Western blot)和免疫组织化学染色法检测翼状胬肉组织中P-S6、CyclinD1、VEGF蛋白的表达,并与正常结膜组织相对比,进一步探讨mTORC1通路在原发性翼状胬肉中可能的作用机制。三、研究结果1、正常结膜组织在光镜下可见有上皮层和基质层,其中上皮层由4-6层复层鳞状上皮细胞构成,基质层为疏松的结缔组织,有散在的毛细血管和少许成纤维细胞。翼状胬肉组织上皮呈明显增生状态,细胞层数多达10层甚至更多,且细胞排列紊乱,有明显的极性。头部浅层基质层有较多的成纤维细胞和大量新生血管伴有炎性细胞的浸润。2、原发性翼状胬肉组织中可见mTOR、P-S6免疫强荧光,其主要表达于原发性翼状胬肉组织上皮细胞层,在人正常球结膜组织仅有少量的mTOR、P-S6免疫荧光呈阳性表达,且荧光强度较弱。经检测原发性翼状胬肉组织mTOR免疫荧光积分光密度(Integral Optical Density,IOD)为(4207000±179900),P-S6免疫荧光IOD为(1872000±1817000),正常结膜组织mTOR免疫荧光IOD、P-S6免疫荧光IOD分别为(185400±32330)、(178500±27950),差异有统计学意义(P<0.05)。3、Western blot检测原发性翼状胬肉中P-S6蛋白/S6蛋白(1.196±0.1015)显著高于正常结膜组织中P-S6蛋白/S6蛋白(0.2952±0.05613),差异有统计学意义(P<0.05);免疫组织化学染色结果显示25例原发性翼状胬肉组织中P-S6均为阳性表达,在11例正常结膜组织中,2例P-S6呈阳性表达,阳性率18.2%(2/11),差异有统计学意义(P<0.05);P-S6在翼状胬肉与正常结膜中免疫组化评分分别为11.36±0.26、2.09±0.31,差异有统计学意义(P<0.05)。4、Western blot检测原发性翼状胬肉中CyclinD1蛋白(1.229±0.07974)显著高于正常结膜组织中CyclinD1蛋白(0.2327±0.03228),差异有统计学意义(P<0.05);免疫组织化学染色结果显示25例原发性翼状胬肉组织中CyclinD1均为阳性表达,在11例正常结膜组织中,1例CyclinD1呈阳性表达,阳性率9.1%(1/11)差异有统计学意义(P<0.05);CyclinD1在翼状胬肉与正常结膜中免疫组化评分分别为11.04±0.32、1.73±0.27,差异有统计学意义(P<0.05)。5、Western blot检测原发性翼状胬肉中VEGF(1.341±0.05731)显著高于正常结膜组织中VEGF(0.2982±0.06974),差异有统计学意义(P<0.05);免疫组织化学染色结果显示25例原发性翼状胬肉组织中VEGF均为阳性表达,在11例正常结膜组织中,3例VEGF呈阳性表达,阳性率27.3%(3/11),差异有统计学意义(P<0.05);VEGF在原发性翼状胬肉与正常结膜中免疫组化评分分别为10.92±1.71、2.18±1.25,差异有统计学意义(P<0.05)。6、经Pearson相关分析,原发性翼状胬肉组织中P-S6和CyclinD1的表达水平呈显著正相关(r=0.752,P<0.05),P-S6和VEGF的表达水平呈显著正相关(r=0.914,P<0.05)。四、结论1、mTOR由mTORC1和mTORC2两种复合物组成,其中mTORC1在调控细胞生长增殖方面起重要作用,P-S6是mTORC1通路下游的标志性位点。经免疫荧光检测,与正常结膜相比较,原发性翼状胬肉组织中mTOR、P-S6蛋白的含量呈增高状态,提示原发性翼状胬肉中存在mTORC1通路的激活。2、原发性翼状胬肉中CyclinD1、VEGF的表达与正常结膜相对比呈高表达状态,且经相关性分析检测P-S6与CyclinD1、VEGF的表达呈显著的正相关,提示mTORC1通路的激活可能进一步引起CyclinD1、VEGF的表达增多,导致细胞生长周期被扰乱,细胞处于持续增殖状态,并有大量新生血管予以营养物质供给,进而导致翼状胬肉的发生发展。