海参中多糖水解酶的提取与性质研究

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本文着重研究海参体壁中的多糖水解酶,以期探寻该酶系与海参体壁自溶溶的相关性,为海参加工工艺中如何防止海参自溶提供理论依据。据研究内容及结果如下:首先,建立了一种灵敏度较高的多糖水解酶活力测定方法-MBTH法。对MBTH法测定多糖水解酶活力做了参数优化,并与目前使用较多的DNS法、铁氰化钾法做了比较。通过对比发现,MBTH法无论是对还原糖的检测还是对多糖水解酶活力检测的灵敏度均高于DNS法及铁氰化钾法,它的检测限分别为4.63μM和2.91U/mL。DNS法测定样品酶活力时工作浓度范围较大,但只对高浓度还原糖检测比较灵敏、准确,对低浓度度还原糖检测不灵敏且曲线不呈线性。与铁氰化钾法相比MBTH法测定酶活力时,工作范围比较大,且灵敏度更高。MBTH法能够将高通量分析应用于海参体壁中多糖水解酶的活力测定,且得到与试管法类似的结果,并且操作方便,一次处理量大,可节省90%的试剂。  其次,本文采用了匀浆浸提、硫酸铵盐析及透析等生化方法,从海参体壁中提取粗酶,并对该粗酶的部分性质进行了初步探讨。以壳聚糖、可溶性淀粉、甘露聚糖、海带多糖、木聚糖、纤维素钠和葡聚糖为底物,发现粗酶中存在能够作用于这些底物、水解底物中的α-1,3、α-1,4和β-1,4糖苷键的多糖水解酶。粗酶中存在最适pH为9.0的壳聚糖酶、淀粉酶、海带多糖酶、木聚糖酶和纤维素酶。粗酶中的多糖水解酶具有良好的热稳定性,在80℃及以上温度下灭活30min后仍具有30-60%的残留活性。这些酶的热稳定性良好,推断其对海参自溶具有影响相关性。  再次,将粗酶中的淀粉酶经过DEAE-52阴离子交换层析和Sephacryl S-300凝胶层析后得到了纯化了18.42倍的酶,通过SDS-PAGE电泳发现该酶具有三个亚基链,分子量分别为99.3 kDa、122.5 kDa和198.2 kDa。对该淀粉酶进行部分特性研究发现,该酶的最适pH为9.0,最适温度为80℃,是一种高温淀粉酶,并且具有较强的热稳定性,在90℃下灭活30min后仍具有30%以上的残留活性。Fe3+和Mn2+对这种淀粉酶具有较强的抑制作用,Cu2+和Ca2+对其有较强的激活作用。
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