论文部分内容阅读
结核病(TB)是长久以来困扰人们生活和工作的呼吸道传播疾病。它是由结核分枝杆菌引起的慢性传染性疾病。1882年科赫发现结核分枝杆菌以来,迄今为止结核病的死亡人数已达数亿人。结核分枝杆菌是一种需氧,无运动能力,生长缓慢,富含脂质的抗酸性染色阳性的分枝杆菌。巨噬细胞是结核分枝杆菌的主要寄居细胞,也是机体抵抗结核分枝杆菌的主要场所。多年来,科学家们致力于结核分枝杆菌与巨噬细胞之间的功能研究,预期找到更为优越的治疗结核分枝杆菌的药物靶点。细胞凋亡在控制结核分枝杆菌在体内的生存及生长过程中具有重要作用,它不仅参与直接清除结核分枝杆菌的固有免疫,而且将凋亡小体提呈给T细胞,进而通过适应性免疫清除结核分枝杆菌。在这种相互依存又相互制约的环境下,结核分枝杆菌也产生多种抗衡手段,其中主要通过结核分枝杆菌自身的毒力蛋白发挥作用。Rv3033是结核分枝杆菌的一个毒力因子,其大小约为19kDa,能够促进结核分枝杆菌在巨噬细胞中的生存。但其在巨噬细胞中的作用尚未可知。因而深入了解与发现Rv3033在巨噬细胞中的功能不但帮助我们揭示这一毒力蛋白的作用机理,同时也为我们找到新的药物靶点提供理论基础和前提。在本研究中,我们通过分子生物学技术,构建上调表达质粒pMSCV–eGFP-Rv3033,包装逆转录病毒感染RAW264.7细胞,构建上调表达Rv3033及Vector的巨噬细胞稳转株(RAW-Rv3033及RAW-Vector)。用Mtb(BCG/H37Rv)感染RAW-Rv3033与RAW-Vector,观察Rv3033对于结核分枝杆菌在巨噬细胞中存活的影响。CFU检测发现,Rv3033能够促进结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。BCG感染RAW-Rv3033及RAW-Vector 12h后,通过高通量测序共发现464个差异表达基因,其中上调表达的差异基因有235个,下调表达的差异基因有229个。差异表达基因的功能主要涉及以下几个过程:凋亡、自噬、细胞周期及炎症等,以细胞凋亡为主。采用结核分枝杆菌减毒株BCG感染RAW-Rv3033与RAW-Vector,观察Rv3033对巨噬细胞凋亡的影响并做机制探讨。结果显示,上调Rv3033能够抑制BCG感染引起的凋亡,并且这种凋亡的抑制现象是通过阻碍ER stress实现的。最后,原核表达纯化Rv3033蛋白,与RAW264.7细胞裂解液共孵育后,pull down寻找与Rv3033相互作用的蛋白。质谱分析后,筛选出8个可能与Rv3033相互作用的蛋白:Lrrfip1,Cofilin-1,Rhog,Rac2,HMGA1,Arhgap15,Arpc4,Tropomodulin-3。综合上述研究结果,我们得出结论:Rv3033能够促进结核分枝杆菌在巨噬细胞中的存活。这一促进作用至少部分是通过抑制结核分枝杆菌感染引起的巨噬细胞凋亡实现的。