论文部分内容阅读
三七[Panax notoginseng(Burk.).F.H.Chen]是我国一种珍贵的中草药,长期以来被用于促进血液循环和治疗瘀伤。大量研究表明三七具有抗血小板聚集、溶栓、降低血压、抗炎等多方面的药理作用,且临床应用疗效显著。但三七较长的生长周期和独特的生长环境容易诱发病害发生。三七根腐病是一种严重的土传病害,全年均可发生,常年的发病率保持在5%～20%,严重时可达到70%。由三七根腐病引发的多种连作障碍更是使得三七种植成本增加,土壤利用率降低,对三七产业化发展相当不利。三七黑斑病是三七种植园中普遍发生的一类叶部病害,是继三七根腐病之后的一类为害较为严重的三七病害,常年的发病率保持在10%左右,严重的时候可占总发病植株60%以上。这类真菌病害的病原真菌以菌丝或厚垣孢子在三七种子、种苗、病根、落叶、残枝和土壤上越冬,并以它们作为传播媒介进行扩散。因此,任何快速、准确的检测病原真菌的方法对防止三七根腐病和三七黑斑病的发生以及流行都具有重要意义。本论文的研究工作及得到的主要结果如下:1.为了建立一种准确、快速的检测三七根腐病的分子检测体系,本研究针对引发三七根腐病的几种镰刀属真菌开发了一套实时荧光定量PCR快速检测方法。通过基因筛选得到了四种镰刀属真菌的基因位点,它们分别是:茄腐镰刀菌的氨基己二酸还原酶Lys2基因、尖孢镰刀菌的脂肪酸ω-羟化酶CYP505基因、轮枝镰刀菌的博来霉素水解酶Bleo基因和禾谷镰刀菌的Aba A基因。基于这些特异的基因位点设计了它们的实时荧光定量PCR引物。并采用实时荧光定量PCR技术构建了它们的定量检测标准曲线,最终建立了三七根腐病中镰刀属致病真菌的实时荧光定量PCR检测方法。对采集到的三七病害样品进行了检测,结果表明,根腐病植株中镰刀属真菌含量显著高于健康植株。表明镰刀属真菌是引起三七根腐病的一类重要致病菌。同时也证明本研究建立的快速分子检测技术灵敏度高,快速,可以为田间三七根腐病、带菌土壤以及种子种苗的快速分子检测提供理论依据和技术支持。2.为了使诊断技术更加简便易行,本研究以茄腐镰刀菌氨基己二酸还原酶Lys2基因为靶点,设计了实时荧光环介导等温扩增引物。运用实时荧光环介导等温扩增方法对7个三七病株样品进行了检测。结果表明,与实时荧光定量PCR相比,荧光定量环介导等温扩增技术速度快,还可以实现扩增与检测同步进行。3.为了快速检测三七黑斑病,本实验建立了检测三七黑斑病病原菌人参链格孢(Alternaria panax)的实时荧光定量PCR方法。通过基因筛选得到了特异扩增人参链格孢的3-磷酸甘油醛脱氢酶GPD基因。并制备了该基因的重组质粒标准品,构建了定量检测的标准曲线,最终建立了人参链格孢的实时荧光定量PCR检测方法。采样检测结果表明三七黑斑病植株中的人参链格孢含量显著高于健康植株且该方法灵敏度高,检测模板浓度可低至0.19 pg/μL。4.链格孢属真菌广泛存在于自然界,是一种重要的作物病害。本实验采集了三七主产区的一种三七叶部病害的样本,从中分离到了一株病原菌,对它进行了致病性分析、形态学鉴定、多位点序列分析和系统进化树构建。分析结果表明本研究分离到的病原菌为交链格孢(A.alternata)。另外,本研究建立了交链格孢的实时荧光定量PCR快速检测体系,采样检测的结果表明这种三七叶部病害植株中的交链格孢的含量显著高于健康植株。综上所述,本研究建立的快速分子检测体系反应快,灵敏度高,能明确三七病株及三七种植土壤中病原真菌数量的动态变化。可以为三七土壤处理、根腐病、黑斑病的早期诊断和动态监测以及后续进一步认识病原真菌的致病机制,并有针对性地研究高效、环保的防治方法提供技术支持。本研究为深入认识三七叶部病害的病原菌及其分子检测奠定了基础。