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糖尿病会对人体骨代谢产生影响,导致I型糖尿病患者骨质疏松,并增加I/II糖尿病患者骨折机率,造成骨折后延迟愈合、不愈合及假关节的出现。同时,糖尿病患者开放性骨折后经常面临皮肤创面,尤其是足部创面难以愈合并最终形成糖尿病溃疡的风险,这是最常见也是最严重的糖尿病并发症之一。随着中国每年糖尿病患者数量的快速增加,皮肤软组织及骨组织缺损的病例亦是逐年递增,而如何让创面及骨组织能够快速愈合并恢复正常成为临床上的棘手问题。因此,急需一种安全、有效、易于推广的方法来促进愈合并阻止晚期严重并发症的发生。目前,主流观点认为缺损区域周边的血管病变及新生血管减少是导致缺损难愈合的最重要的局部原因之一。随着对于糖尿病患者血管病变机理研究的深入,目前认为低氧诱导因子信号通路(hypoxia inducible factor-1α/HIF-1α)的失调在该病理进程中起着至关重要的作用。去铁胺(desferrioxamine/DFO)是一种能够在常氧条件下激活HIF-1α信号通路的化合物,称为“低氧模拟化合物”。因此低氧模拟化合物可能对糖尿病患者骨与软组织缺损修复具有潜在作用。目前,静电纺丝及水凝胶等新型材料技术制备的支架是药物的优良载体,能够实现药物定点、定量及可控缓释。如何将低氧模拟化合物与生物材料有机结合并应用于骨与软组织修复,值得我们进行深入有益的探索。目的构建负载低氧模拟化合物的新型支架材料,通过体内、体外实验验证其易于血管化的作用并阐述其分子机制及细胞信号通路。方法1.腹腔注射链脲霉素(streptozotocin/STZ)诱导I型糖尿病SD大鼠(type 1 diabetes mellitus sprague dawley rat/T1DM SD rat),与同周龄正常大鼠进行对比,通过Micro-CT、三点弯曲力学试验验证其骨质疏松存在,并通过Western blot证实高血糖环境中HIF-1α通路受损。利用静电纺丝技术构建负载DFO的PCL(polycaprolactone)管状纤维支架,通过扫描电镜观察支架材料微观结构。体外选用小鼠骨髓间充质干2细胞(murine bone marrow stem cells/m BMSCs)验证载药材料的生物相容性,并利用Realtime-PCR技术检测该细胞在支架释放药物干预下相关成血管及成骨m RNA表达情况;选用人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell/HUVEC)检验材料成管特性。体内试验中,构建T1DM大鼠股骨远端骨缺损模型,通过Micro-CT、X-ray、组织形态学等方法评价DFO对糖尿病骨质疏松性骨缺损修复的作用。2.构建携载DFO的亲水性PVA(polyvinyl alcohol)-CS(chitosan)复合静电纺丝纤维膜,通过扫描电镜、FTIR(fourier transform infrared spectroscopy)光谱仪等方法检测材料表征及药物缓释效果,随后验证其生物特性。体外选用人皮肤原代成纤维细胞(human dermal fibroblast/HFB)验证载药材料的生物相容性并检测HIF-1α等相关成血管蛋白表达情况;选用HUVEC检验材料成管特性。体内试验中,在T1DM大鼠背部构建全层皮肤缺损;利用组织形态学、Realtime-PCR、Western blot等方法评价创面愈合速度及质量,同时阐明HIF-1α信号通路变化。3.通过物理共混方法将DFO与可注射光交联Gelma(gelatin methacrylamide)水凝胶相结合,构建复合载药支架材料。通过扫描电镜观察支架微观表征及药物分布情况。利用紫外分光光度计检测药物缓释效果。体外选用HFB及HUVEC检验支架生物相容性及相关蛋白表达情况。体内通过构建T1DM大鼠背部全层皮损模型,利用组织形态学实验验证水凝胶支架材料修复效果。结果1.T1DM大鼠存在明显的骨质疏松,HIF-1α信号通路受损。负载DFO的PCL管状纤维支架具有良好的生物相容性并能够上调m BMSCs内成血管相关的vegf以及成骨相关的runx-2、osteocalcin的m RNA的高表达,并能有效诱导HUVEC成管;DFO干预组大鼠股骨远端骨缺损处的骨密度、骨量、血管含量较对照组明显升高;骨骼中HIF-1α、RUNX-2蛋白表达要高于对照组,成骨活跃,愈合速度加快。2.携载DFO的亲水性PVA-CS复合静电纺丝纤维支架拥有优秀的吸水和机械性能,微观纤维结构能够有效促进HFB粘附、增殖,细胞内HIF-1α、VEGF等成血管相关蛋白表达量均高于对照组。同时可以促进HUVEC有效成管;在体内,纤维支架材料具有与创面愈合进程相匹配的降解速度及药物释放速度,可以快速募集成血管相关细胞及因子进入损伤区域,并能够加强HFB及HUVEC两种细胞的协同作用,生成血管、促进表皮再生、加速I/III型胶原转化,最终修复创面。3.负载DFO的光交联Gelma水凝胶支架材料具有良好的生物相容性,形态可塑且不受创面大小、深浅限制,能够为细胞长入、增殖、分化提供相对封闭稳定的3D微环境,并能够有效促进HFB内HIF-1α蛋白高表达。在体内,该水凝胶为创面处微脉管系统重建提供有效结构支持,并通过调控HIF-1α及其下游VEGF高表达而快速诱导血管长入,加速创面愈合。结论负载DFO的多孔生物材料支架为细胞及组织粘附、长入、增殖提供了优良的三维微环境并能够根据修复进程梯度释放药物,从而通过激活HIF-1α信号通路实现快速血管化并修复糖尿病骨及皮肤软组织缺损。