论文部分内容阅读
乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus，JEV)引起的一种严重威胁人畜健康的病毒性疾病。对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一。对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。猪是JEV的重要储存宿主和扩增宿主，带毒猪是JE的主要传染源。因此，控制猪的JE不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。
为了解目前华南部分地区猪场JE的流行状况，本研究采用乳胶凝集试验对华南部分地区养猪场的722份血清进行了猪JE抗体的检测，结果显示，JE血清抗体总阳性率平均为77.84％。其中东莞地区的血清阳性率最高，达100％;江门地区的JE血清抗体阳性率为85.45％；韶关地区的阳性率最低，仅为65.91％。在对各阶段猪的JE抗体检测中发现，公、母猪的血清抗体阳性率分别为93.03％和92.23％，由于公母猪已进行了多次免疫，说明免疫效果较好。而育肥猪、保育仔猪和哺乳仔猪的血清抗体阳性率分别为41.67％、38.18％和24.44％，由于仔猪和育肥猪一般不做JEV的免疫，抗体阳性说明该阶段可能存在猪JEV的自然感染。因此，本研究应用RT-PCR方法对华南部分地区23个不同规模猪场的263份流产死胎病料和4900余只蚊子进行了病原学检测。结果显示，1份流产死胎和l份蚊子样品RT-PCR结果呈阳性，即扩增出了与预期大小相符的片段。对RT-PCR初步检测阳性的病料上清液采用乳鼠脑内接种和BHK-21细胞分离病毒，并用RT-PCR结合测序方法进行鉴定。结果在1份流产死胎病料中成功分离出1株JEV，命名为JEV/GD/2009株。
为探讨疫苗株SA14-14-2与当前JEV流行株的遗传进化关系，本研究将JEVSA14-14-2株在BHK-21细胞上传至3代，命名为SA14-14-2-B3株，应用RT-PCR技术获得了SA14-14-2-B3株全基因组序列。该毒株基因组全长为10977个核苷酸，5-UTR由95个核苷酸组成，3’-UTR由583个核苷酸组成，含有一个单一的开放阅读框(ORF)，该ORF全长为10299个核苷酸，编码3432个氨基酸。JEV SA14-14-2-B3株核苷酸和氨基酸序列相似性分析表明，SA14-14-2-B3株与疫苗株SA14-14-2、SA(A)及野毒株SA14的核苷酸和氨基酸序列相似性最高，分别为99.8％、99.9％、99.4％和99.7％、99.8％、99.1％；与国外猪源分离株JEV/sw/Mie/41/2002、KV1899、FU的核苷酸和氨基酸序列相似性最低，分别为88.6％、88.5％、89.1％和97.6％、96.6％、97.2％。比较发现在SA14-14-2-B3株基因组第10700nt处有一碱基“G，’的插入。基于JEV SA14-14-2-B3株全基因组的遗传进化分析显示，SA14-14-2-B3株与SA14源病毒株SA14、SA14-14-2、SA(A)、SA(V)及国内JEV分离株Beijing-1、p3、WHe、HW同处一个大分支，亲缘关系较近，而与国内JEV分离株XJP613和HEN0701亲缘关系较远。基于SA14-14-2-B3株E基因的遗传进化分析表明，SA14-14-2-B3株与SA14源病毒株SA14、SA14-14-2、SA(A)、SA(V)及国内JEV分离株Beijing-1、p3、WHe、HW同属于JEV基因III型，另外两个国内JEV分离株XJP613和HEN0701属于JEV基因I型。
为了更有效快速的检测猪JEV，本研究针对E基因建立了一种新型的可视化反转录环等温扩增（Reverse transcriptase loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）方法，这种新型的可视化RT-LAMP640C反应80min即可通过目测产物颜色而判定结果。使用本方法对细胞培养的JEV进行检测，结果均为阳性，扩增产物电泳图谱及NcoI酶切分析验证了该RT-LAMP产物具有较高的特异性。对CSFV、PRRSV、PRV和PCV-2（阳性病料）进行检测，结果均为阴性，其检测的准确率和特异性均为100％。敏感性试验显示，本方法可以检测到10pg的JEV RNA。使用本方法对人工接种JEV发病死亡的乳鼠脑组织进行检测，结果显示，该RT-LAMP方法可以成功的检测出脑组织样品中的JEV RNA。本研究建立的新型可视化RT-LAMP具有快速、特异、敏感、无需昂贵仪器及结果可视化等优点，在临床检测JEV中具有较大的应用价值。