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猪链球菌(Streptococcus suis, S.suis)是一种重要的人兽共患病病原菌,根据其表面荚膜多糖(Capsular polysaccharide, CPS)的抗原性,可以分为1-31、33和1/2共33个血清型,其中2型猪链球菌(Streptococcus suis serotype2, S.suis2)是毒力最强、临床检出率最高的血清型。近年来多次出现S.suis2感染人事件,引起业界人士的高度关注。尤其值得关注的是,近年在我国江苏“苏中”地区和四川资阳等市县猪养殖业从业人群中曾先后两次暴发了大规模的S.suis2感染人的事件,人感染病例中出现高比例的、国内外罕见的链球菌中毒性休克综合症(Streptococcus toxic shock syndrome, STSS),该型病症可致高病死率(达80%以上)。长期以来,细菌表面蛋白一直都被视为重要的致病相关因子而引起广泛研究。细菌表面蛋白外切糖苷酶是病原菌侵袭宿主的识别受体,同时也是细菌感染与定植宿主细胞的一种重要的酶。本课题组前期完成了S.suis2强毒株05ZYH33(分离自STSS病人)的全基因组测序,并对基因组进行功能注释。结果显示,05ZYH33基因组中编码1个外切糖苷酶——β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,BgaC)同源分子,根据其编码基因所在阅读框的位置及其功能注释,将其命名为BgaC,同源性比对发现该BgaC与多种链球菌(肺炎链球菌、停乳链球菌等)的氨基酸序列一致性高达63%以上。现已证实在肺炎链球菌中,BgaC可以通过水解作用抑制或破坏细菌和宿主上皮细胞间的链接,可水解宿主细胞表面半乳糖基团Galβ1-3GlcNAc,从而改变肺炎链球菌对宿主细胞的粘附及其在鼻咽部的侵袭定植能力。而在猪链球菌中,对于BgaC的研究国内外尚未见报道。本研究以中国强致病株05ZYH33基因组编码的p-半乳糖苷酶为主要研究对象,探索分析BgaC在S.suis2中的功能。主要研究结果如下：1BgaC编码基因bgaC的克隆表达与多抗制备以S.suis2p-半乳糖苷酶BgaC编码基因bgaC为靶序列,设计引物经PCR扩增获得目的基因片段,克隆入表达载体pET28a中进行原核表达,亲和层析法纯化重组蛋白。ELISA结果显示,重组蛋白BgaC能够刺激小鼠产生较高效价的免疫抗体,Western Blot结果显示,重组蛋白具有良好的免疫原性。2BgaC重组蛋白的生物学功能研究将构建好的BgaC重组蛋白进行酶学活性分析,由酶学性质分析可知该酶的酶活反应最适温度为42℃,最适pH为5.5,最佳反应时间为30min,最适底物浓度为10mM。酶学动力学分析,发现该酶的反应常数Km为0.398mM,最大反应速率为7.43×10-3mM/min, Kcat为5.63×102/s。在最适条件下,重组S.suis2BgaC的体外酶活为1615U/ml,酶比活为1076U/mg。利用高效液相色谱(HPLC).免疫电镜及流式细胞术等技术进一步证实在S. suis2中,BgaC是定位于细菌表面的可特异性水解半乳糖基团Ga1β1-3GlcNAc的蛋白。3bgaC基因突变株的构建以S. suis2强毒株05ZYH33为对象,基于同源重组原理构建中间为壮观霉素(SPC)、两侧为bgaC基因上下游片段的重组质粒,将构建好的质粒电转化入S. suis2感受态,筛选bgaC缺失的突变株,通过PCR分析及测序结果筛选突变株。4突变株△bgaC的生物学功能研究体外实验结果显示突变株△bgaC经过反复传代培养后可以稳定生长,壮观霉素抗性表型能够在敲除株中稳定表达。在相同条件下,观察发现敲除株与野生株的菌落形态和溶血活性均无明显差别,但突变株的成链能力明显弱于野生株。通过绘制生长曲线,突变株与野生株的生长速率无明显差别。AbgaC突变株对人喉癌上皮细胞(Hep-2)的粘附能力明显增强,抗吞噬结果表明,AbgaC突变株抗小鼠巨噬细胞(Raw264.7)的吞噬能力增加；RT-PCR结果显示该基因bgaC可以调控其下游的部分PTS组分。小鼠毒力试验显示,05ZYH33野生株与突变株△bgaC攻毒后,致死率差异不具有统计学意义。综上所述,研究发现S. suis2β-半乳糖苷酶蛋白大小,细菌表面定位,酶学活性,BgaC在S. suis2感染宿主细胞过程中,参与细菌对宿主的黏附。以上研究结果为进一步探索p-半乳糖苷酶在S. suis2中的致病机理奠定了基础。