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高通量测序技术具有测序速度快、成本低、通量高等优点，其发展给生物学多个领域的研究带来了一场空前的革命。DNA甲基化和基因表达、基因印迹、发育、衰老、癌症发生等生物过程有着密切的关系。DNA甲基化在全基因组上的分布，对于系统性的研究DNA甲基化在上述生物过程中的作用有着重要的作用。以往，基因组DNA甲基化的研究由于受限于检测方法，往往仅限于基因组的局部区域和位点。即使将高密度基因芯片应用到DNA甲基化研究领域，由于全基因组覆盖式芯片价格昂贵，所以一些研究往往也只能覆盖有限的CpG岛或者是部分染色体。高通量测序技术的问世，为真正意义上的全基因组甲基化检测提供了一个有力的工具。本论文以白血病细胞系K562为研究对象，结合高通量测序技术和甲基化DNA免疫沉淀技术(MeDIP-Seq)对全基因组DNA甲基化检测进行了研究，重点研究了MeDIP-Seq的文库制备方法、数据分析方法以及K562细胞系的全基因组甲基化分布特征。主要研究内容和成果如下：
1．用于全基因组DNA甲基化分析的MeDIP-Seq文库制备方法。
MeDIP-Seq是一种全新的全基因组甲基化分析方法。它是将甲基化DNA免疫沉淀和高通量DNA测序技术结合在一起的一种策略。甲基化DNA免疫沉淀技术，使用甲基化胞嘧啶抗体，或者甲基化结合蛋白，将甲基化DNA片段从非甲基化片段中有效的分离出来。甲基化DNA免疫沉淀技术和高通量测序技术相结合，可以有效的识别基因组中甲基化的片段，从而绘制全基因组的DNA甲基化图谱。该方法相比较与亚硫酸氢盐反转测序的优点在于，不需要较多的测序通量、成本低，数据处理方法简单，无需高性能运算服务器用于大规模的基因组拼接。但是，在实际应用中MeDIP技术和高通量测序技术结合主要存在两点障碍：1）MeDIP的产物量太少。4-5μg的全基因组DNA底物，经过MeDIP免疫沉淀后，大约能够得到200ng左右的MeDIP产物。这个量对于制备高通量测序文库有一定的难度。2)基因组DNA经过MeDIP反应之后，由原来的双链DNA变成单链DNA。因为anti-5mC抗体识别单链DNA上甲基化胞嘧啶效果较好，所以在免疫沉淀之前，基因组DNA经过了变性的过程，而单链DNA并不适合制备高通量测序文库。为此，我们设计了一对带有酶切位点的通用接头，在MeDIP之前将接头连接到DNA片段两端。MeDIP完成后，利用通用引物对MeDIP产物进行扩增，再利用特异性内切酶将接头完全切除，以制备高通量测序文库。我们用该方法成功的制备了白血病细胞系K562的MeDIP-Seq测序文库，并用亚硫酸氢盐反转测序结果验证了所制备文库的测序结果，结果显示两者呈现显著相关性（R2=0.92，Pearson检验）。我们用两次重复实验验证了文库制备方法的可重复性，结果显示两次实验的测序reads分布呈显著相关性（R2=0.92，Pearson检验）。结果证明我们的方法提供了一种稳定、可靠的MeDIP-Seq文库制备策略。
2．基于SOLiD测序方法的改进型MeDIP-Seq文库制备方法。
我们开发的原始MeDIP-Seq文库制备方法使用了包含内切酶识别位点的通用接头。这种接头的使用克服了MeDIP文库量少、单链，这两个不利于制备测序文库的缺点。同时这种接头也引入了另外一些风险，主要包括：1）酶切不完全，导致测序文库包含接头序列；2）酶切可能破坏文库中其他包含有该酶切位点的区域：3）酶切以及酶切完成后的文库纯化造成测序文库损失。为此，我们设计了一种无需切除通用接头的MeDIP-Seq文库的制备方法。这种方法借助了制备测序文库的SOLiD接头来扩增MeDIP文库，而取代了外源接头。且该方法制备的测序文库只包含MeDIP产物的两端序列，不包含MeDIP产物的中间序列，提高了MeDIP产物的测序效率，同时为从测序reads定位MeDIP产物提供了更准确的方法。我们比较了该方法和原始方法制备的两组文库的测序reads，证明该制备方法并没有产生任何偏向性，且和原始方法制备的文库有显著相关性（R2=0.92，Pearson检验）。同时结果显示该方法制备的文库相对于原始方法，可用reads的比例有一定程度的提高。结果证明优化后的方法能够提供更好的MeDIP-Seq文库制备方法。
3．MeDIP-Seq测序数据的生物信息学分析研究。
利用MeDIP-Seq技术来绘制全基因组甲基化图谱的一个重要的关键点在于如何从庞大的、复杂无序的测序数据中提取DNA甲基化的分布信息。本论文提出了一种基于泊松分布的搜峰方法，通过MeDIP-Seq数据在全基因组范围内识别甲基化区域。在这项研究中，我们分别比较了不同的分布模型和搜峰窗宽对结果的影响。我们用泊松分布和负二项分布来拟合MeDIP-Seq数据，比较研究的结果显示泊松分布更适合于MeDIP-Seq数据的分析。我们对不同搜峰窗宽对结果的影响进行比较，结果显示取MeDIP产物的长度(500bp)为搜峰窗宽可得到最好的效果。另外，我们还研究了用MeDIP-Seq数据推算DNA的绝对甲基化水平。结果显示相对于我们开发的基于泊松分布的搜峰方法，该工作需要更多量的测序数据。研究结果表明，基于泊松分布的搜峰方法可以作为一种可靠、准确的MeDIP-Seq数据分析工具。
4．K562细胞系全基因组甲基化分析。
我们以白血病细胞K562为研究对象，利用MeDIP-Seq的测序结果，绘制了K562细胞的全基因组甲基化图谱，识别了约1.4×105个不短于500bp的甲基化区域，并对甲基化区域在转录起始位点上游区(TSS-upstream)、转录终止位点下游区（TES-downstream）、3’非翻译区(3’untranslated region，3UTR)、5’非翻译区（5’untranslated region，5’UTR）、内含子(Intron)、外显子(Exon)等特征区域的分布进行了描述。我们还对基因启动子区、CpG岛的甲基化进行了研究。研究结果表明DNA甲基化更趋向于分布在基因的3’末端、基因间区而非基因的5’末端，同时我们发现了部分已经被证明和癌症、白血病相关的抑癌基因的启动子区发生甲基化。同时我们分析了DNA甲基化和CpG位点密度的关系，结果表明DNA甲基化趋向于分布在中等CpG密度区域而非高CpG密度区域。DNA甲基化在全基因组分布的研究为今后研究DNA甲基化和疾病的关系提供了一种可行的策略。