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目的:探讨硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)在小鼠柯萨奇病毒B3(Coxsackie virusesB3,CVB3)心肌炎中的作用及机制。
方法:实验选取清洁级近交系4-6周龄雄性Balb/C小鼠70只,随机分为四组:心肌炎阴性对照组(N组,10只)、心肌炎阳性对照组(C组,20只)、心肌炎干预组(P组和S组,各20只)。C、P、s组分别在第0天每只小鼠腹腔注射0.1m110-5.69 TCID50/ml的CVB3制作心肌炎模型,N组从第0天起每只小鼠每日腹腔注射不含病毒的等量灭菌PBS液,此后P或S组于从第0天起予以炔丙基甘氨酸(DL-proparglygylcine，PAG)40mg/kg/d或硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)50μmol/kg/d腹腔注射,C组对应予以等量磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)作为对照。实验观察记录至接种第10天各组随机取10只小鼠,记录小鼠体重和心脏重量,处死后留取心脏标本检测。Reed-Muench法测定接种病毒滴度；Log-rank检验对心肌炎各组间进行生存率的比较；苏木素伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色后光镜观察心肌组织病理学改变及并采用Rezkalla法计算炎症积分；应用免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)检测胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine garnmalyase,CSE)、诱生型一氧化氮合酶(induci ble nitric oxide synthase,NOS2)和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达的分布含量,逆转录多聚酶链反应(reverse transcription-polyrmerase chain reaction,RT-PCR)检测CSEmRNA，NOS2mRNA，HO-1mRNA含量,免疫蛋白印迹(Western blot)检测CSE蛋白、NOS2蛋白含量。
结果:
1.小鼠一般情况和和生存曲线比较:接种病毒小鼠出现倦怠,耸毛,蜷缩在一起,腹泻,进行性体重下降,死亡；而未接种病毒小鼠健康活泼,体重逐渐增加,无小鼠死亡。接种病毒后第5天开始,C组、P组出现死亡,第6天开始S组出现死亡,至第10天C、P、S组分别死亡8、11、6只。Log-rank检验C、P、S组之间小鼠生存率无显著统计学差异(P>0.05)。
2.心肌病理改变:N组心肌细胞结构正常,未见炎性细胞浸润和心肌细胞死亡；C组心肌出现炎症细胞浸润,间质水肿,血管充血,心肌肿胀坏死；P组心肌有广泛炎性细胞浸润和心肌组织的坏死；S组心肌有炎性细胞浸润,坏死心肌区域小。
3.心肌炎症积分比较:N组心肌无炎性改变组织坏死,P组积分显著高于C组(P<0.05),S组积分显著低于C组(P<0.05)。
4.心肌/体重比的比较:用心肌重与体重比值反映心肌水肿程度。病毒感染组比值均显著高于阴性对照组(P<0.05),P组比值显著高于C组(P<0.05),S组比值显著低于C组(P<0.05)。
5.免疫组化检测心肌组织CSE、NOS2、HO-1表达
5.1心肌组织CSE蛋白平均吸光度(mean optical density,MOD)比较:N组在血管内皮细胞上呈弱阳性表达,而C组在血管内皮细胞和心肌细胞上呈阳性表达,C组MOD值显著高于N组(P<0.05)。
5.2心肌组织NOS2蛋白MOD值比较:N组为阴性表达,C组在心肌细胞上呈阳性表达,P组心肌上呈强阳性表达,S组有轻度阳性表达。病毒感染组MOD值均显著高于N组(P<0.05),P组MOD值显著高于C组(P<0.05),S组MOD值显著低于C组(P<0.05)。
5.3心肌组织HO-1蛋白MOD值比较:N组阴性表达,C组在心肌细胞上呈阳性表达,P组呈轻度阳性表达,S组呈阳性表达。病毒感染组MOD值均显著高于N组(P<0.05),P组MOD值显著低于C组(P<0.05),S组MOD值显著高于C组(P<0.05)。
6.RT-PCR检测心肌组织CSEmRNA,NOS2mRNA,HO-1mRNA含量
6.1心肌组织匀浆CSEmRNA条带光密度比较:C组显著高于N组(P<0.05)
6.2心肌组织匀浆NOS2mRNA条带光密度比较:N组弱表达,C和P组条带光密度值均显著高于N组(P<0.05),P组条带光密度值显著高于C组(P<0.05),S组条带光密度值显著低于C组(P<0.05)。
6.3心肌组织匀浆HO-1mRNA条带光密度比较:N组弱表达,C和S组条带光密度值均显著高于N组(P<0.05),P组条带光密度值显著低于C组(P<0.05),S组条带光密度值显著高于C组(P<0.05)。
7.Werstern blot检测心肌组织CSE蛋白,NOS2蛋白含量
7.1心肌组织匀浆CSE蛋白条带光密度比较:C组显著高于N组(P<0.05)
7.2心肌组织匀浆NOS2蛋白条带光密度比较:N组弱表达,感染组条带光密度值均显著高于N组(P<0.05),P组条带光密度值显著高于C组(P<0.05),S组条带光密度值显著低于C组(P<0.05)。
8.相关性分析
8.1小鼠心肌炎症病理积分与NOS2免疫组化阳性表达的平均吸光度呈显著正相关(r=0.674,P<0.05,n=24)
8.2小鼠心肌炎症病理积分与HO-1免疫组化阳性表达的平均吸光度呈显著负相关(r=-0.701,P<0.05,n=24)
结论:
1.CSE/H2S通路在小鼠CVB3心肌炎中上调。
2.H2S可通过抑制NOS2过度表达,在小鼠CVB3心肌炎中起到保护心肌作用。
3.H2S可通过诱导HO-1表达,在小鼠CVB3心肌炎中起到保护心肌作用。
方法:实验选取清洁级近交系4-6周龄雄性Balb/C小鼠70只,随机分为四组:心肌炎阴性对照组(N组,10只)、心肌炎阳性对照组(C组,20只)、心肌炎干预组(P组和S组,各20只)。C、P、s组分别在第0天每只小鼠腹腔注射0.1m110-5.69 TCID50/ml的CVB3制作心肌炎模型,N组从第0天起每只小鼠每日腹腔注射不含病毒的等量灭菌PBS液,此后P或S组于从第0天起予以炔丙基甘氨酸(DL-proparglygylcine，PAG)40mg/kg/d或硫氢化钠(sodium hydrosulfide,NaHS)50μmol/kg/d腹腔注射,C组对应予以等量磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline,PBS)作为对照。实验观察记录至接种第10天各组随机取10只小鼠,记录小鼠体重和心脏重量,处死后留取心脏标本检测。Reed-Muench法测定接种病毒滴度；Log-rank检验对心肌炎各组间进行生存率的比较；苏木素伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色后光镜观察心肌组织病理学改变及并采用Rezkalla法计算炎症积分；应用免疫组化法(immunohistochemistry,IHC)检测胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine garnmalyase,CSE)、诱生型一氧化氮合酶(induci ble nitric oxide synthase,NOS2)和血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)蛋白表达的分布含量,逆转录多聚酶链反应(reverse transcription-polyrmerase chain reaction,RT-PCR)检测CSEmRNA，NOS2mRNA，HO-1mRNA含量,免疫蛋白印迹(Western blot)检测CSE蛋白、NOS2蛋白含量。
结果:
1.小鼠一般情况和和生存曲线比较:接种病毒小鼠出现倦怠,耸毛,蜷缩在一起,腹泻,进行性体重下降,死亡；而未接种病毒小鼠健康活泼,体重逐渐增加,无小鼠死亡。接种病毒后第5天开始,C组、P组出现死亡,第6天开始S组出现死亡,至第10天C、P、S组分别死亡8、11、6只。Log-rank检验C、P、S组之间小鼠生存率无显著统计学差异(P>0.05)。
2.心肌病理改变:N组心肌细胞结构正常,未见炎性细胞浸润和心肌细胞死亡；C组心肌出现炎症细胞浸润,间质水肿,血管充血,心肌肿胀坏死；P组心肌有广泛炎性细胞浸润和心肌组织的坏死；S组心肌有炎性细胞浸润,坏死心肌区域小。
3.心肌炎症积分比较:N组心肌无炎性改变组织坏死,P组积分显著高于C组(P<0.05),S组积分显著低于C组(P<0.05)。
4.心肌/体重比的比较:用心肌重与体重比值反映心肌水肿程度。病毒感染组比值均显著高于阴性对照组(P<0.05),P组比值显著高于C组(P<0.05),S组比值显著低于C组(P<0.05)。
5.免疫组化检测心肌组织CSE、NOS2、HO-1表达
5.1心肌组织CSE蛋白平均吸光度(mean optical density,MOD)比较:N组在血管内皮细胞上呈弱阳性表达,而C组在血管内皮细胞和心肌细胞上呈阳性表达,C组MOD值显著高于N组(P<0.05)。
5.2心肌组织NOS2蛋白MOD值比较:N组为阴性表达,C组在心肌细胞上呈阳性表达,P组心肌上呈强阳性表达,S组有轻度阳性表达。病毒感染组MOD值均显著高于N组(P<0.05),P组MOD值显著高于C组(P<0.05),S组MOD值显著低于C组(P<0.05)。
5.3心肌组织HO-1蛋白MOD值比较:N组阴性表达,C组在心肌细胞上呈阳性表达,P组呈轻度阳性表达,S组呈阳性表达。病毒感染组MOD值均显著高于N组(P<0.05),P组MOD值显著低于C组(P<0.05),S组MOD值显著高于C组(P<0.05)。
6.RT-PCR检测心肌组织CSEmRNA,NOS2mRNA,HO-1mRNA含量
6.1心肌组织匀浆CSEmRNA条带光密度比较:C组显著高于N组(P<0.05)
6.2心肌组织匀浆NOS2mRNA条带光密度比较:N组弱表达,C和P组条带光密度值均显著高于N组(P<0.05),P组条带光密度值显著高于C组(P<0.05),S组条带光密度值显著低于C组(P<0.05)。
6.3心肌组织匀浆HO-1mRNA条带光密度比较:N组弱表达,C和S组条带光密度值均显著高于N组(P<0.05),P组条带光密度值显著低于C组(P<0.05),S组条带光密度值显著高于C组(P<0.05)。
7.Werstern blot检测心肌组织CSE蛋白,NOS2蛋白含量
7.1心肌组织匀浆CSE蛋白条带光密度比较:C组显著高于N组(P<0.05)
7.2心肌组织匀浆NOS2蛋白条带光密度比较:N组弱表达,感染组条带光密度值均显著高于N组(P<0.05),P组条带光密度值显著高于C组(P<0.05),S组条带光密度值显著低于C组(P<0.05)。
8.相关性分析
8.1小鼠心肌炎症病理积分与NOS2免疫组化阳性表达的平均吸光度呈显著正相关(r=0.674,P<0.05,n=24)
8.2小鼠心肌炎症病理积分与HO-1免疫组化阳性表达的平均吸光度呈显著负相关(r=-0.701,P<0.05,n=24)
结论:
1.CSE/H2S通路在小鼠CVB3心肌炎中上调。
2.H2S可通过抑制NOS2过度表达,在小鼠CVB3心肌炎中起到保护心肌作用。
3.H2S可通过诱导HO-1表达,在小鼠CVB3心肌炎中起到保护心肌作用。