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研究目的研究不同微波消融功率消融后肝脏损伤区域的变化和范围,对大鼠肝脏消融靶向区域进行基因转染,观察基因转染效果。分析热损伤导致的肝脏的变化,探讨热损伤可能促进基因转染的机制,为热损伤联合基因治疗为基础的肝脏肿瘤基因治疗提供实验基础。研究方法本实验首先通过开腹后微波消融大鼠肝脏,消融区域分为针道炭化区、凝固坏死区、炎性反应区和正常肝组织区。为证明热损伤导致的炎性反应区(靶向区域)细胞膜选透性的改变利于实现基因转染的推断,通过不同功率的消融及相应消融区域的细胞生理功能及形态的变化范围大小可以选定特定功率和相应功率下炎性反应区的范围。微波消融建立特定功率下的大鼠肝脏消融模型。根据相关文献实验动物消融所用功率选定功率分别为20W、25W和30W,消融时间设置为60S。消融结束后关腹,分别在术后第一、三、五、七天处死大鼠,取肝脏消融标本,沿消融针道及垂直针道的方向利用特定直径为2mm的模具取肝脏标本,行HE染色,确定两个方向上靶向区的范围。进一步在消融针道横径及纵径方向行肝脏靶向区域局部注射及门静脉高压注射表达绿色荧光蛋白(GFP)的目的质粒和海肾荧光素酶质粒于已建模的大鼠肝脏,分别进行体内转染。采用冰冻切片技术,利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,通过全波长多功能酶标仪测定质粒的表达程度；并通过全波长多功能酶标仪联合海肾荧光素酶质粒试剂盒测定质粒的表达程度,评估转染情况与目的基因的表达效率。研究结果1.通过设定微波三个不同功率消融大鼠肝脏,取各区域的消融肝脏标本后通过HE染色可以确定消融后第一天及第三天的炎性反应区(靶向区)的范围。最终确定消融后第一天在横径方向上30W、25W、20W不同功率形成靶向区的范围为(0.892±0.097,1.183±0.113) cm、(0.583±0.052,0.783±0.068) cm、(0.567±0.082,0.775±0.076)cm；在纵径方向上为(0.750±0.055,1.017±0.075)cm、(0.583±0.098,0.792±0.092) cm、(0.550±0.055,0.758±0.058) cm;第三天在横径方向上30W、25W、20W不同功率形成靶向区的范围为(0.833±0.137,1.175±0.154) cm、(0.667±0.103,0.908±0.086) cm、(0.567±0.052,0.767±0.041cm；在纵径方向上为(0.800±0.110,1.067±0.121)cm、(0.700±0.089,0.933±0.075) cm,(0.550±0.084,0.775±0.082) cm。2.转染对照组(微波消融+空质粒组、GFP表达质粒单纯注射组)第一、三、五、七天冰冻切片观察未及明显荧光表达。阳性对照组门静脉高压注射组可及明显荧光表达,荧光表达较实验组规则,荧光强度略低于实验组。3.目的质粒GFP实验组(微波消融+GFP质粒注射组)与其它各组相比较,倒置荧光显微镜观察靶向区域冰冻切片可于第一天、第三天、第五天、第七天均可见绿色荧光。第三天的切片荧光程度明显强于第一天、第五天、第七天,第五天荧光表达程度开始衰弱,第七天荧光程度明显衰弱。4.全波长多功能酶标仪绿色荧光蛋白发光值测定：结果显示转染对照组(微波消融+空质粒组、GFP表达质粒单纯注射组)在第一天和第三天的荧光强度(第一天：360.7±31.97,6422.7±680.29第三天：323.7±15.10,8837.2±1334.18)明显低于实验组(第一天：10754.2±507.42第三天：24163.3±1522.90)(P<0.05)和阳性对照组门静脉高压注射组(第一天：10428.0±418.49,第三天：22172.83±866.30)(P<0.05),实验组与阳性对照组质粒表达程度无明显差别(第一天：P=0.631,第三天：P=0.282)(P0.05)。5.目的质粒海肾荧光素酶质粒实验组检测结果(1)通过利用海肾荧光素酶试剂盒联合全波长多功能酶标仪在海肾荧光素酶质粒转染术后第一天(POD1)实验组的发光值(36.2±1.33)RLU与对照组第一天单纯海肾荧光素酶质粒注射组(23.0±0.63)RLU、微波消融+空质粒组的发光值(20.2±2.23)RLU差异均有统计学意义(P<0.05),实验组的发光值高于对照组。与第一天阳性对照组(门静脉高压注射海肾荧光素酶质粒组)发光值(46.7±2.25)RLU差异有统计学意义(P<0.05)。实验组发光值低于阳性对照组。(2)在转染术后第三天(POD3)实验组海肾荧光素酶质粒发光值(46.7±2.25)RLU与第三天对照组单纯海肾荧光素酶质粒注射组(32.0±2.60)RLU、微波消融+空质粒组(23.2±1.94)RLU差异均有统计学意义(P<0.05),实验组的值高于对照组。与第三天阳性对照组门静脉高压注射组的发光值(92.7±4.27)RLU差异有统计学意义(P<0.05)。实验组发光值低于阳性对照组。(3)在转染术后第一天(POD1)实验组(36.2±1.33)RLU和门静脉高压注射组的海肾荧光素酶质粒发光值(46.7±2.25)RLU和第三天(POD3)实验组(46.7±2.25)RLU和门静脉高压注射组的发光值(92.7±4.27)RLU差异均有统计学意义(P<0.05),POD3荧光素酶质粒发光值明显强于POD1。(4)在转染术后第五天(POD5)以及第七天(POD7)实验组与门静脉高压注射组发光值差异均有统计学意义(P<0.0.5),在相同时间段,实验组的发光值低于相应的门静脉高压注射组。研究结论微波消融后炎性反应区(靶向区)局部直接注射质粒载体可实现基因转染,但转染效率低于门静脉高压注射。提示一定程度的热损伤有利于促进肝脏靶向区细胞的基因转染。本实验为探讨热损伤促进肝脏细胞基因转染机制提供了一定的实验基础。