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胃癌仍是全球第二位恶性肿瘤,发病率仅次于肺癌,是我国死亡人数最多的恶性肿瘤之一。近二十年来,尽管内镜技术的进步大大提高了早期胃癌的诊断及疗效,胃癌总的五年生存率仍低于20%。转移是胃癌患者死亡的主要原因。深刻理解胃癌转移的分子机制对探讨有效的新的治疗策略十分重要。上皮特异性细胞粘附分子EpCAM是最早应用单克隆抗体技术鉴定出的肿瘤相关抗原之一。它以多聚体的形式广泛表达于上皮组织表面,介导钙非依赖性细胞间同型黏附功能,据此可归入粘附分子家族。晚近的研究提示EpCAM还具备粘附分子家族的其他特性,参与包括细胞与基质的相互作用、迁移、细胞分化、形态、细胞周期调节、信号传导、代谢等多种过程。同时,EpCAM在多种上皮来源的肿瘤中呈过表达,提示其与肿瘤密切相关。多项研究已证实EpCAM的表达与乳腺癌和结肠癌细胞的增殖、周期分布、转移有关。目前EpCAM已作为肿瘤标志物协助诊断及判断预后。2002年EpCAM抗体作为为数不多的被批准用于临床的单抗之一,在德国获准上市,用于结肠癌和乳腺癌的术后辅助治疗。2006年,EpCAM首届国际研讨会的召开,预示着EpCAM正在成为肿瘤研究者关注的热点。关于EpCAM与胃癌的研究较少,仅有两篇文献报道其在胃癌中高表达,而其对胃癌恶性表型的影响及其机制尚无研究。【目的】1、探讨EpCAM在胃癌中的表达及与临床病理特征的相关性;2、探讨EpCAM的下调是否可影响胃癌的多种恶性表型尤其是浸润和转移;3、研究EpCAM调节胃癌浸润转移可能的分子机制。【方法】1、利用免疫组化观察EpCAM在胃癌组织中的表达,分析其与胃癌临床病理特征的关系,尤其是比较其在转移和无转移胃癌组织中表达的差异,观察EpCAM表达与转移是否相关;2、RT-PCR和Western blot研究EpCAM在多种胃癌细胞系的表达;3、基因重组的方法构建含有EpCAM特异性siRNA的表达载体;4、用构建的特异性siRNA表达载体转染胃癌细胞,经G418筛选获得稳定表达的克隆;5对稳定表达的克隆进行Western blot鉴定,明确不同载体的转染效果;6、MTT试验绘制转染细胞和对照细胞的生长曲线;7、流式细胞术分析转染细胞和对照细胞的周期分布;8、AV/PI双染色法分析转染细胞和对照细胞的凋亡;9、克隆形成试验-平板克隆形成试验和软琼脂克隆形成试验观察转染细胞和对对照细胞在体外的成瘤能力;10、体外迁移试验、体外粘附试验、体外侵袭试验观察转染细胞和对照细胞体外的运动、粘附、侵袭能力;11、裸鼠体内肝脏转移实验观察转染细胞体内转移能力的变化。12、凝胶酶谱法检测转染胃癌细胞上清中分泌MMP2,MMP9的活性变化;13、Western blot检测MMP2,MMP9,TIMP-1,2蛋白水平的表达变化;14、、Western Blot检测下调EpCAM与NFκB信号通路相关分子表达水平变化的关系。【结果】1、EpCAM在胃癌中呈过表达,尤其在有转移胃癌中表达增高。采用免疫组化技术检测100例胃癌中EpCAM的表达,发现其主要定位于胞膜,部分弥散到胞浆。胃癌组织74%的病例呈过表达(74/100),较正常组织表达率明显增高,其表达与肿瘤分化程度相关。并发现EpCAM在转移胃癌中表达的阳性率(90%,45 /50)高于无转移的胃癌(58%,29/ 50),免疫组化评分结果亦显示,EpCAM在有转移的胃癌中表达高于无转移的胃癌(9.91±1.98 versus 5.43±2.32, P<0.05),说明EpCAM更多地表达在有转移的胃癌组织,但EpCAM在有转移胃癌原发灶和转移灶中的表达没有明显差异。RT-PCR和western blot结果显示, SGC7901和AGS细胞系的EpCAM mRNA和蛋白水平表达均较高。2、EpCAM下调可抑制胃癌细胞的体外粘附、侵袭、移动及裸鼠体内肝脏转移能力。成功构建两个含有EpCAM特异性siRNA的表达质粒pSilencer-EpCAM。转染胃癌细胞SGC7901和AGS,G418筛选获得稳定表达的克隆,蛋白水平检测证实成功建立了EpCAM表达下调的稳定细胞系,两个siRNA沉默EpCAM的效果类似。MTT检测细胞生长情况,结果发现EpCAM表达下调的细胞系生长减慢。细胞周期检测显示,EpCAM-siRNA转染细胞G1期比例和S期减少,增殖指数降低,AV/PI染色显示细胞凋亡比例无变化。克隆形成实验显示,EpCAM-siRNA转染细胞生长减慢,克隆形成率显著低于空载体对照组。粘附试验显示,EpCAM-siRNA转染细胞对细胞外基质模仿物Matrigel的粘附能力降低,4h时粘附细胞数的差异最为明显。侵袭和转移试验显示,EpCAM-siRNA可以抑制SGC7901和AGS细胞的侵袭和移动能力。EpCAM siRNA1和siRNA2转染使AGS侵袭细胞数分别减少了50.1%和50.4%;裸鼠体内肝脏转移实验表明,EpCAM-siRNA可以显著抑制胃癌细胞的肝脏转移能力。以上结果提示,EpCAM下调可抑制胃癌细胞增殖、侵袭、迁移、转移等多种恶性表型。3、EpCAM siRNA抑制胃癌转移的作用部分与调节NFκB信号转导通路抑制MMP-2,9而上调TIMP1的表达有关。采用Western blot和明胶酶谱法证实EpCAM siRAN能下调MMP-2,9活性和非活性形式的表达,并能上调TIMP1的蛋白表达,而对TIMP2的表达没有显著影响。抗体阻断实验证实,MMP-2和MMP-9的抗体对EpCAM高的SGC7901亲本及空载体对照细胞或表达下调的转染细胞的侵袭能力都有明显的抑制,此作用在EpCAM高表达细胞系中的效应更明显。进一步研究发现,EpCAM siRNA可以下调IKKα、IKKβ和NFκB (p65/RelA亚单位)的蛋白水平以及IκBα的磷酸化水平而上调IκBα的蛋白水平。以上结果提示EpCAM siRNA抑制胃癌转移的作用至少部分是通过对NFκB信号通路的抑制从而下调MMP-2、MMP-9表达和上调TIMP1表达实现的。【结论】EpCAM的表达与胃癌的转移状态呈正相关;EpCAM siRNA有抑制胃癌细胞侵袭、浸润和转移的能力;EpCAM siRNA抑制胃癌转移的作用至少部分是通过对NFκB信号通路的抑制从而下调MMP-2、MMP-9表达和上调TIMP1表达实现的。研究结果显示EpCAM在胃癌中扮演着癌基因的角色,为EpCAM在胃癌转移的分子治疗和诊断中的应用提供了实验依据。