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呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)是儿科常见的呼吸道病原之一,属副黏病毒科肺炎属,为多形、外有蛋白包裹的核内RNA病毒,表面功能蛋白主要有两类:F蛋白和G蛋白,其中F蛋白主要介导胞膜融合及传入,引起Th1型炎症反应；而G蛋白主要介导吸附,引起Th2型炎症反应。目前普遍认为RSV感染所造成的免疫异常表现为Th1/Th2细胞功能和比例失衡,表现为Th1细胞及其分泌的因子不足,Th2细胞数量增多和功能亢进。RSV感染呈全球性分布,具有显著的季节性,多流行于冬春两季。主要表现为毛细支气管炎和肺炎,严重时可引起梗阻性肺气肿,甚至可致呼吸衰竭、心力衰竭等。RSV感染还可引起哮喘等其他呼吸系统疾病的发生和发作。
T-bet,是2000年发现的一种Th1细胞特异性转录因子,在Th1细胞分化中起核心作用。通过激活IFN-γ的基因转录,T-bet可诱导自身再表达,再通过细胞因子诱导初始Th(Th0)细胞向Th1细胞的分化,甚至在其他转录因子的协同作用下可将分化中的Th2和已完全分化的Th2细胞逆转为Th1细胞,伴随大量的IFN-γ产生,并抑制Th2类细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13等)的产生。T-bet还能直接抑制Th2细胞特异性转录因子,进而抑制Th2细胞分化及促进Th1细胞分化。
研究目的:通过模拟自然感染途径,在建立小鼠RSV感染模型的基础上,进一步探讨经鼻T-bet基因转染对小鼠气道炎症的影响。
研究方法:1.建立小鼠原发性RSV感染模型。健康6～8周龄SPF级Balb/c小鼠36只,按随机数字表法分为四组。对照组:Hep-2细胞培养上清液给Balb/c小鼠滴鼻,实验组:用三个不同滴度的RSVLong株给Balb/c小鼠滴鼻,每个滴度一组。分别在第3天、5天、8天无菌取出肺组织,用于病毒分离、病毒滴度测定和病理学检查。2.健康6～8周龄SPF级Balb/c小鼠40只,按随机数字表法分为四组:正常对照组(A组):Hep-2细胞培养上清液滴鼻五天后,予293细胞培养上清液滴鼻；RSV感染模型组(B组):Hep-2细胞培养RSV液滴鼻五天后,293细胞培养上清液滴鼻；模型/对照病毒载体(rAAV-eGFP)干预组(C组):Hep-2细胞培养RSV液滴鼻五天后,293细胞包装rAAV-eGFP液滴鼻；模型/rAAV-T-bet干预组(D组),Hep-2细胞培养出RSV液滴鼻五天后,293细胞包装rAAV-T-bet液滴鼻；每组10只,试验处理在腹腔麻醉的基础上进行。第二次滴鼻7天后,每组选择6只小鼠用于肺泡灌洗,灌洗液离心后作细胞计数,离心后的上清液用于测定IL-4和IFN-γ水平,另外4只用于病理学分析。
结果:1.结合小鼠的表现、肺组织病毒分离、病毒滴度的检测及肺组织病理学变化,共同表明成功建立了小鼠RSV感染模型。2.在建立小鼠RSV感染模型的基础上,经鼻应用rAAV-T-bet转染传递T-bet基因,通过对模型小鼠气道内各种可被转染细胞免疫失衡的调控,进而实现抑制肺内炎症反应的作用:B组小鼠BALF中细胞总数和淋巴细胞计数百分比分别为(43.91±10.41)×106/ml,(65.15±1.88)％,A组分别为(14.52±3.57)×106/ml、(25.79±1.07)％,A、B两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；D组小鼠BALF中细胞总数和淋巴细胞计数百分比分别为(24.84±4.35)×106/ml,(29.48±11.97)％,与B组和C组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。组织病理切片观察:A组小鼠气道无明显炎症变化,B组和C组小鼠小支气管、血管黏膜下和周围肺组织有明显的炎症细胞浸润,血管壁明显水肿；D组小鼠气道炎症明显减轻。B组小鼠BALF中IL-4和IFN-γ,水平分别为(74.32±10.06)pg/ml,(89.36±20.38)pg/ml,A组小鼠分别为(6.01±1.02)pg/ml,(177.32±18.16)pg/ml,A、B两组比较差异有统计学意义(P<0.05)；D组小鼠BALF中IL-4和IFN-γ水平分别为(49.14±7.59)pg/ml,(145.28±43.52)pg/ml,与B、C组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)。
结论:1.采用高滴度的RSV Long株予小鼠滴鼻,可成功建立Balb/c小鼠RSV肺部感染的模型。2.气道内T-bet基因转染能有效改善RSV感染模型小鼠气道内细胞因子IL-4和IFN-γ异常,同时对淋巴细胞在肺内聚集及肺组织炎症的改变有一定抑制作用。