论文部分内容阅读
温带树木在其一生中反复经历寒冷到温暖的转换,从而进化出一种机制确保在严寒的冬天停止形成层活动,而在接下来适宜的春天重新激活。关于这个现象的机制研究主要集中在转录组分析和激素调控方面。植物微小RNA(mieroRNAs,miRNAs)通过在转录后或者翻译水平调控靶基因,并在许多细胞和发育过程中发挥重要作用。但是,迄今为止还不知道miRNAs是否参与木本植物形成层休眠期到活动期的转换过程调控。 在本研究中,首先建立了稳定的人工诱导杨树(Populus alba×Populusglandulosa)休眠以及休眠解除实验体系。在此基础上,利用小RNA(small RNAs,sRNAs)的深度测序技术系统地研究了在形成层休眠维持和解除过程中具有显著性表达差异的miRNAs。研究结果显示:参与植物发育时期转换的miR156和miR172家族在形成层休眠期到活动期的转换过程中具有相反的表达模式:参与生长素信号通路的miR160家族特异性地在被动休眠期表达,而其它生长素信号通路的miRNAs则在活动期表达;参与植物个体发育的miRNAs除了miR166家族之外,都在活动期高表达:而所有与抗逆相关的miRNAs都在休眠期高表达。在此基础上分析并确认了miR169家族在形成层休眠期到活动期转换过程中的表达变化,发现保守的miR169成员在活动期高表达,休眠期低表达;而在杨树中特有的一类miR169表达模式正好相反。这些结果表明在杨树中miR169家族不同成员的功能出现了分化。对预测的杨树miR169的靶基因Nuclear Factor Ysubunit A(NFYA)家族成员PagHAP2.1进行了功能研究,结果显示:PagHAP2.1基因是酵母(Saccharomyces cerevisiae)Heme Activated Protein2(HAP2)的同源基因,在转录水平受ABA诱导,它在形成层活动期中能被Pag-miR169a/n/r中的至少一个剪切。过表达.PagHAP2.1基因的转基因拟南芥比野生型耐受ABA诱导的叶片衰老。在本氏烟草(Nicotiana benthamiana)叶片中的瞬时表达实验表明Pag-miR169a能够通过剪切PagHAP2.1基因来降低其对ABA的抵抗作用。 为了研究杨树miR166在休眠期高表达的调控机制,首先检查了现有的关于miR166基因功能的研究结果。通过文献检索进一步发现一类参与DNA损伤和复制的相关基因的功能缺失突变体和miR166a/g在拟南芥中过表达具有相似的表型。因此本研究检测了其中的染色质装配因子CAF-1蛋白复合体组分基因FASCIATA2(FAS2)与维管组织发育以及miR166表达调控之间的关系。结果显示:拟南芥FAS2基因的确参与了维管组织的发育,它特异地定位在花序轴的韧皮部中;形态学实验显示fas2-4突变体中花序轴维管束的细胞数目明显少于野生型;韧皮部功能检测实验表明fas2-4突变体运输同化物的能力减弱:蔗糖处理能够明显加重fas2-4突变体的表型;启动子缺失实验证实是一段含有3个DOF转录因子结合位点的45 bp顺式元件控制FAS2基因特异在维管束中表达;在fas2-4突变体检测到miR166a/g前体的上调,在杨树休眠期中检测到FAS2基因下调以及miR166的上调,意味着FAS2基因参与了miR166的表达调控,并且在拟南芥和杨树中具有相似的调控机制。 本研究系统研究了miRNAs在形成层休眠维持和解除过程中的表达模式变化,重点分析了杨树miR169家族及其靶基因PagHAP2.1的表达模式和功能。这些结果揭示了miRNAs在杨树形成层休眠维持和解除过程中可能的调控网络,为研究miRNAs在转录后水平调控形成层休眠维持和解除过程提供了新的思路,并为进一步寻找在形成层活动周期中起重要作用的靶基因提供了丰富的信息。同时,对拟南芥FAS2基因的功能研究,初步建立了拟南芥FAS2基因与维管组织发育之间的关系,为进一步从FAS2的上游调控基因和下游可能的miE|RNAs靶标入手研究维管组织发育奠定了良好的工作基础。