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随着生活污水和工农业废水的大量排放，使得我国的湖泊、水库富营养化加剧，是造成蓝藻生长和水华暴发的主要原因。另外，全球气候变化可能加剧了蓝藻水华暴发的发生频率和强度。微囊藻属Microcystis是蓝藻中一个很重要的类群，是多数富营养化水体中水华发生的优势种类。长期以来，关于微囊藻水华暴发过程和机理的研究备受关注，然而，对微囊藻的衰亡过程研究却相对较少。这种情况阻碍了深刻认识微囊藻水华消长的全过程以及水华有毒次生代谢产物在衰亡期如何释放到环境中。因此，本论文对过氧化氢、低温、黑暗和UVB辐射胁迫条件下微囊藻的响应特征及其机理进行了系统的研究，揭示了微囊藻响应环境胁迫产生类细胞凋亡的现象，为阐明微囊藻水华衰亡过程、途径和驱动机制提供理论依据。主要研究内容和结果如下:
1.从细胞形态，生理和分子等多方面寻找实验证据，探讨H2O2是否能够诱导铜绿微囊藻FACHB-905产生细胞凋亡。当H2O2浓度为250和325μM时，应用透射电子显微镜观察到细胞膜变形，部分类囊体瓦解。与此相应地，Hoechst33342染色表明细胞内类核区染色质浓缩。而且，藻细胞的损伤伴随着光合效率(Fv/Fm，ETRmax)的大幅度降低以及caspase-3-like活性的增加。原位末端脱氧核苷酸转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测显示250和350μMH2O处理组藻细胞出现TUNEL阳性细胞，且阳性细胞比例随H2O2浓度增加。这些数据表明，250和325μMH2O2处理的微囊藻细胞存在细胞凋亡的特征。此外，H2O2处理的藻细胞又显示出空泡化现象，没有典型的DNA梯状条带以及人工合成抑制剂Z-VAD-FMK并不抑制增加的caspase-3-like活性。因此，H2O2可依剂量诱导微囊藻细胞产生类细胞凋亡。
2.过氧化氢可抑制藻类生长，同时会导致微囊藻毒素(Microcystins，MCs)的释放。以铜绿微囊藻FACHB-905为研究对象，研究外源微囊藻毒素MC-LR对H2O2胁迫下铜绿微囊藻生理生化变化的影响。结果表明:在H2O2胁迫下，微囊藻的生长和光合活性受到显著抑制，藻细胞存活率降低，ROS含量明显增加，SOD活性上升。与单独H2O2胁迫相比，加入MC-LR能增加微囊藻细胞的存活率。24h和48h后，在培养基中加入的MC-LR可以缓解250μMH2O2对微囊藻光合系统PSⅡ活性的抑制作用。当微囊藻暴露于250μMH2O2环境中时，添加了MC-LR处理组藻细胞中的ROS含量明显减少(P＜0.05)。在相同浓度H2O2且加入了外源MC-LR后藻细胞SOD活性下降(P＜0.05)。因此，微囊藻毒素MC-LR可缓解H2O2引起的氧化损伤并增强微囊藻自身的生存能力。我们的研究结果有利于阐明H2O2胁迫影响产毒蓝藻生长代谢的途径及MCs生物学意义。
3.在实验室条件下设计了15℃、4℃低温和黑暗胁迫条件，比较研究这些模拟胁迫条件下铜绿微囊藻FACHB-905的细胞形态和生理生化变化特征，同时对这三种胁迫后微囊藻的回复生长规律也进行了初步研究。结果表明:在胁迫期间，15℃处理对微囊藻的生长、PSⅡ活性影响较弱，但对氧还脱氢酶活性有显著影响，类胡萝卜素/叶绿素a的比值明显高于对照组和其他处理组。4℃处理影响微囊藻的生长，光合系统活性急剧下降，到第11天ETRmax和Ik值已降到零，MTT阳性细胞比例也逐渐下降，到第23天时4℃处理组Caspase-3-like相对活性增加(P＜0.05），第30天发现少量细胞TUNEL检测呈阳性。黑暗处理影响微囊藻的生长，Fv/Fm和ETRmax值持续下降，到第29天只有5％的细胞呈MTT阳性，氧还脱氢酶活性在大部分细胞中丧失，但Caspase-3-like活性没有显著变化。经过30天胁迫处理后微囊藻细胞转入正常条件，各组处理组藻细胞活性有不同程度的恢复，但是4℃处理恢复有一段延滞期相对较慢。比较这几种胁迫条件发现微囊藻对4℃胁迫的耐受力较弱，且有少量细胞死亡特征与细胞程序性死亡类似。
4.研究4℃低温和黑暗胁迫条件对铜绿微囊藻FACHB-905和FACHB-915毒素合成和释放的影响。结果表明:铜绿微囊藻FACHB-905和FACHB-915在正常培养期间胞外毒素的释放总是保持较低的水平;当受到4℃低温、黑暗胁迫时，胞外毒素含量明显低于对照组但其胞外释放比率有所升高，这可能主要来自于衰亡细胞释放出的毒素。转入正常条件后，4℃和黑暗处理组胞外毒素含量有明显上升的趋势。对照组胞内毒素和总毒素含量随培养时间的延长而逐渐增大，而4℃和黑暗处理组总毒素含量无显著变化，且明显低于对照组。但是除对照组在第2天有最大净产毒率，后续的培养中对照组与4℃低温、黑暗处理组的净产毒率无明显差异。推测4℃低温、黑暗胁迫对微囊藻毒素含量的影响是间接通过藻细胞生长而造成的，并不是直接影响铜绿微囊藻细胞产毒。
5.由于大气臭氧层变薄及臭氧空洞的出现导致到达地表的UVB(280-320nm)辐射增强，从而增加了水生生物暴露于UVB辐射的风险。水华蓝藻由于通过光合作用获得能量，且经常暴露于水体表面，因此不可避免要受到UVB辐射影响。在正常光照和黑暗条件下，研究环境强度的UVB辐射(0.51W/m2)对三株铜绿微囊藻的损伤。通过测定细胞数来判定藻株的增殖能力;同时通过自发荧光、SYBRgreen染色、免疫染色、TUNEL检测等评估藻细胞受到的损伤尤其是在亚细胞水平如染色质和细胞骨架元素等。结果表明:UVB辐射可抑制微囊藻的生长，导致藻细胞自发荧光猝灭，细胞骨架结构瓦解，DNA损伤以及加剧藻细胞的沉降，甚至导致部分细胞死亡。与产毒株PCC7806和FACHB905相比，非产毒株PCC7005更易受到UVB辐射的有害影响，恢复能力较弱。与黑暗条件相比，微囊藻在有光条件下对UVB辐射更敏感。此外，结合卢布尔雅那（斯洛文尼亚首都）十一年连续UVB辐射测量值，探讨实验结果的生态学意义。温带地区UVB辐射增加在春季和初夏（蓝藻形成过程中）作用最强，这一段时间UVB可能影响蓝藻水华的形成和组成，有利于产毒株的生长。
综上所述，微囊藻细胞在环境胁迫条件下可产生类细胞凋亡的现象，微囊藻毒素能通过直接或间接作用提高微囊藻自身在胁迫条件下的生存能力。臭氧层破坏导致UVB辐射的增加与全球气候变化可能是未来温带地区有害蓝藻（尤其是产毒微囊藻）水华更加频繁形成的重要原因。我们的研究结果为预测蓝藻水华衰亡，为控制或减轻衰亡过程中因蓝藻毒素释放可能引起的生态和健康危害提供了理论依据。