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肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是肝脏最常见的恶性肿瘤,在世界范围内普遍流行,最新的流行病学调查显示,其发病率位于所有恶性肿瘤中第五位,肿瘤致死性疾病中第三位,并且发病率具有一定的性别差异,于男性中排名第三位,女性中第八位。HCC生长速度快、恶性程度高,常伴有血管侵犯、肝内及肝外转移、治疗后复发等,预后差,其5年生存率仅仅为3%-25%,严重危害着人类的健康。目前仍未完全阐明HCC的发病机制,因此,探究新的分子靶点及信号通路具有重要的科研及临床意义。Micro RNAs(miRNAs)是一类单链的,长度约为14-24个核苷酸,非编码的小RNA片段,可以特异性结合至靶基因的3’末端非翻译区(3’end of the untranslated regions,3’-UTR),导致靶基因的降解或抑制靶基因的翻译,从而调控多个生理及病理过程,例如细胞增殖、周期、分化、凋亡等基本生命过程。大量的研究结果显示,miRNA在肿瘤的发生发展过程中扮演了促癌或抑癌的角色,miRNA的功能失调会影响肿瘤的发生及进展。miRNA可能成为肿瘤诊断、治疗的一个潜在的小分子生物标记。代谢是有机体生命活动最基本的特征。生命有机体细胞的代谢需要消耗大量的能量,包括糖代谢、脂代谢、核苷酸代谢等,而其中糖代谢是细胞获得能量的主要方式和途径。葡萄糖在细胞内通过氧化磷酸化和糖酵解两种途径分解供能。正常情况下,葡萄糖由细胞膜上的葡萄糖转运体(GLUTs)转运进入细胞,再经过一系列生物过程生成丙酮酸,然后进入线粒体内经三羧酸循环(TCA)氧化生成二氧化碳和水,并产生ATP供能。当细胞处于低氧环境下,葡萄糖则以糖酵解的方式为细胞供能,生成丙酮酸后不再进入线粒体内,而是在乳酸脱氢酶的作用下产生乳酸及质子,同时生成少量的ATP。肿瘤细胞具有一个特征,即使在氧气供应充分的状况下,仍然表现出较高水平的糖酵解,并以此来供应能量,称为有氧糖酵解或Warburg效应。这种重新编程的代谢方式为肿瘤细胞的快速生长提供了有利的条件,绕过了线粒体TCA循环,从而以更快的速率产生ATP,并且可以将葡萄糖碳转移,用来合成核苷酸、脂质、蛋白质等生物大分子,满足肿瘤细胞快速生长所需。因此,有氧糖酵解途径可以作为肿瘤治疗的一个靶点。miRNA可通过调控糖代谢促进或抑制肿瘤的生长、侵袭、迁移等,而miR-342-3p可以抑制肝癌、肺癌、宫颈癌、结肠癌、膀胱癌等多种肿瘤的进展,但是关于miR-342-3p在糖代谢中的作用未见报道。综上,我们推测miR-342-3p可能通过调节糖酵解作用从而抑制肝细胞癌的进展。本研究中,我们通过动物实验(体内)、细胞实验(体外),应用多种细胞生物学、分子生物学的方法如细胞转染、RNA干扰、q RT-PCR、荧光素酶报告基因检测等,阐述miR-342-3p是否调控肝癌细胞的糖酵解,并进一步探讨其靶基因IGF-1R及下游信号通路在miR-342-3p调控肝癌细胞糖酵解中的作用及机制。第一部分miR-342-3p调控肝癌细胞的糖酵解作用目的:探讨糖酵解与miR-342-3p调控肝癌细胞的增殖是否相关。方法:通过细胞转染技术,并应用糖酵解抑制剂2-脱氧-D-葡萄糖(2-Deoxy-D-glucose,2-DG)处理肝癌细胞,然后通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)检测方法连续测定细胞生长并绘制时间生长曲线,及细胞克隆形成实验,阐述糖酵解与miR-342-3p调控肝癌细胞的增殖是否相关。应用RT-PCR检测miR-342-3p表达水平。结果:1.生长曲线及克隆形成实验结果显示,与阴性对照组相比,转染miR-342-3p后Hep G2细胞增殖能力降低。(P<0.01)2.生长曲线及克隆形成实验结果显示,与阴性对照组相比,转染miR-342-3p后MHCC97H细胞增殖能力降低。(P<0.01)3.生长曲线及克隆形成实验结果显示,miR-342-3p并加入2-DG组与NC并加入2-DG组间的差异,和单纯转染miR-342-3p组与NC组间的差异,二者相比,加入糖酵解抑制剂2-DG后,miR-342-3p抑制Hep G2细胞增殖能力的作用减弱。4.生长曲线及克隆形成实验结果显示,miR-342-3p并加入2-DG组与NC并加入2-DG组间的差异,和单纯转染miR-342-3p组与NC组间的差异,二者相比,加入糖酵解抑制剂2-DG后,miR-342-3p抑制MHCC97H细胞增殖能力的作用减弱。结论:1.miR-342-3p可以抑制人肝癌细胞增殖。2.miR-342-3p通过调节糖酵解抑制人肝癌细胞增殖。第二部分miR-342-3p靶向调控IGF-1R目的:探索miR-342-3p与靶基因的相互作用及对信号转导的影响。方法:本研究通过细胞转染技术,转染miR-342-3p阴性对照物、模拟物、抑制物后,运用western blot、RT-PCR技术,观察miR-342-3p对靶基因及下游信号通路的影响。并构建靶基因3’-UTR野生型及突变体质粒DNA,进一步通过荧光素酶报告基因实验,验证miR-342-3p与其靶基因的靶向调节关系。结果:1.应用miro RNA靶基因预测软件Target Scan和miRanda预测miR-342-3p的靶基因后并行Western blot检测,证实miR-342-3p抑制IGF-1R的表达。2.人肝癌细胞转染miR-342-3p模拟物后,抑制IGF-1R的表达及磷酸化水平,进一步抑制AKT的磷酸化,及GLUT1的表达。3.人肝癌细胞转染miR-342-3p抑制物后,促进IGF-1R的表达及磷酸化水平,进一步促进AKT的磷酸化,及GLUT1的表达。4.人肝癌细胞转染miR-342-3p模拟物后,抑制IGF-1R m RNA的表达。(P<0.01)5.人肝癌细胞转染miR-342-3p抑制物后,促进IGF-1R m RNA的表达。(P<0.01)6.荧光素酶活性实验验证miR-342-3p与靶基因IGF-1R的结合关系,结果显示,与对照组相比,IGF-1R基因3′-UTR野生型质粒与miR-342-3p模拟物共转染人肝癌细胞后,显著降低报告基因的荧光素酶活性。而miR-342-3p模拟物对IGF-1R基因3′-UTR突变型质粒荧光素酶活性无明显影响。(P<0.01)结论:1.IGF-1R为miR-342-3p的靶基因。2.miR-342-3p抑制IGF-1R介导的PI3K/AKT/GLUT1信号通路的转导作用。第三部分miR-342-3p通过IGF-1R调节糖酵解抑制肝癌生长目的:探索miR-342-3p是否由IGF-1R介导调控肝癌细胞的糖酵解。方法:应用细胞转染技术、RNA干扰技术,转染miR-342-3p对照物、模拟物、IGF-1R si RNA或IGF-1R表达载体,检测对肝癌细胞生长、葡萄糖的摄取水平、产生ATP和乳酸的能力、以及细胞外酸化率(ECAR)和氧消耗率(OCR)的影响。结果:1.miR-342-3p可以抑制人肝癌细胞的生长及克隆形成能力。敲低IGF-1R后,miR-342-3p抑制肝癌细胞生长及克隆形成的作用消失。(P<0.05)2.miR-342-3p可以抑制人肝癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸及ATP的产生。敲低IGF-1R后,miR-342-3p抑制人肝癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸及ATP产生的能力消失。(P<0.05)3.miR-342-3p可以抑制人肝癌细胞的生长。共转染miR-342-3p及IGF-1R后,使miR-342-3p对肝癌细胞生长的抑制作用回转。(P<0.05)4.miR-342-3p可以抑制人肝癌细胞的葡萄糖摄取、乳酸及ATP的产生。共转染miR-342-3p及IGF-1R后,使miR-342-3p对肝癌细胞葡萄糖摄取、乳酸及ATP产生的抑制作用回转。(P<0.05)5.miR-342-3p可以抑制人肝癌细胞的ECAR。敲低IGF-1R后,miR-342-3p抑制人肝癌细胞ECAR的能力消失。(P<0.05)6.miR-342-3p可以促进人肝癌细胞的OCR。敲低IGF-1R后,miR-342-3p促进人肝癌细胞OCR的能力消失。(P<0.05)结论:IGF-1R介导的糖酵解作用参与了miR-342-3p抑制肝癌生长的过程。第四部分miR-342-3p对裸鼠肝癌模型体内糖酵解的调控与机制目的:探索动物体内miR-342-3p是否通过IGF-1R来抑制肝癌细胞的糖酵解作用。方法:裸鼠皮下成瘤,通过PET成像显示肿瘤组织对葡萄糖的摄取能力,通过乳酸比色试剂盒测定肿瘤组织内乳酸生成水平,应用Western blot检测肿瘤组织内相关蛋白的表达水平。结果:1.裸鼠皮下成瘤后,予以注射放射性核素18F标记的FDG(18F-FDG),并行PET扫描,与对照组比较,miR-342-3p过表达的肿瘤组织对葡萄糖摄取能力下降,并且肿瘤的生长受到抑制。(P<0.01)2.与对照组比较,miR-342-3p过表达的肿瘤组织内乳酸生成能力下降。(P<0.01)3.与对照组比较,miR-342-3p过表达的肿瘤组织内IGF-1R、p IGF-1R、p AKT、GLUT1表达水平降低。(P<0.01)结论:在裸鼠肝癌模型体内,IGF-1R介导的PI3K/AKT/GLUT1信号通路参与了miR-342-3p抑制肝癌生长及糖酵解的过程。结论:1.miR-342-3p通过调节糖酵解抑制人肝癌细胞增殖。2.miR-342-3p抑制IGF-1R介导的PI3K/AKT/GLUT1信号通路的转导作用。3.IGF-1R介导的糖酵解作用参与了miR-342-3p抑制肝癌生长的过程。4.裸鼠肝癌模型体内,IGF-1R介导的PI3K/AKT/GLUT1信号通路参与了miR-342-3p抑制肝癌生长及糖酵解的过程。