论文部分内容阅读
硫代双乙醇(thiodiglycol, TDG或者TG)作为中间体合成糜烂性毒剂芥子气,同时也是芥子气的水解产物,被定义为具有“双重使用价值”的化合物。芥子气是目前为止使用过的毒性最强的化学武器之一。TDG在环境中相对持续存在,同时可残留在土壤中几年至几十年。TDG与水混溶,对地下水造成威胁,且在环境中能与芥子气的水解产物和其他化合物反应形成毒性更强和持续性更强的化合物。TDG必须降解处理被列入了《化学武器公约》。应用生物来治理有毒、难降解、环境危害性的有机污染物不仅经济、安全,而且所能处理的污染物阂值低、残留少,受到世界各国的普遍重视,相关研究也十分活跃。生物降解在世界各国销毁芥子气储备中发挥了重要作用。生物降解TDG不仅是要筛选到能够降解相应有机化合物的培养物,更重要的是对降解微生物的遗传性能和降解特性的研究,后者不仅能有助于控制降解过程,亦可揭示在环境压力下微生物进化的机制。英国兰卡斯特大学李红教授的前期研究中分离获得了具有TDG降解能力的微生物,因此本论文对具有TDG降解能力的微生物进行了遗传学特征和降解性能的研究。研究结果如下：1.降解菌株的纯化和鉴定。以李红教授提供的降解细菌为研究出发点,采用选择性培养基对菌落进行梯度稀释和涂布培养,纯化出2株菌株：01S和01B。分别提取其总DNA进行16SrDNA测序。采用BLAST进行同源搜索并比较,得到01S菌株和01B菌株的16SrDNA序列与多株伯克霍尔德菌属(Burkholderia)的16SrDNA序列高度相似,相似度大于97%,初步确定这两个菌株为伯克霍尔德菌属(Burkholderia),命名为Burkholderia sp.01S和Burkholderia sp.01B。通过系统进化树的构建,发现01S菌株和01B菌株与Burkholderia xenovorans LB400具有更接近的分类学地位,为Burkholderia sp.01S与相邻物种的比较基因组学和功能基因组学分析提供了基础。2.TDG降解菌的生长和降解特性研究。选取Burkholderia sp.01S为研究对象。通过正交实验,表明Burkholderia sp.0lS的最佳生长条件为：pH7.0,温度30℃,碳源TDG的浓度为500ppm。通过对照试验以及LC-MS检测,TDG能被菌株降解,排除非生物损耗的可能。采用在基础盐培养基中进行富集培养的方式,逐渐加大碳源TDG的浓度,驯化培养降解菌。与原菌相比,驯化菌对TDG的耐受浓度提高到1100ppm。底物降解广谱性试验结果显示,菌株Burkholderia sp.01S可利用的碳源为正丁醇、TDG、甘油和丁二酸。含硫有机物(TDG)为伯克霍尔德菌属新增加的有机物降解类型。通过生物功能比较,发现与Burkholderia sp.01S分类学地位最接近的B. xenovorans LB400无TDG降解能力。3. Burkholderia sp.01S的全基因组测序与分析。Burkholderia sp.01S基因组大小为9.12Mb,共编码8632个预测基因,基因区总长度为7,601,499bp, GC含量63.07%,基因区占基因组百分比85.36%,基因平均长度880bp,基因间区长度1,303,046bp,基因间区占基因组百分比14.63%。与B. xenovorans LB400进行比较基因组学分析,二者有5812个直系同源基因,且直系同源基因进化树的构建结果二者最为接近。B. xenovorans LB400的两个核心染色体序列在Burkholderia sp.01S基因组中对应关系较好,而巨型质粒序列在Burkholderia sp.01S基因组中几乎未曾发现。推测Burkholderia sp.01S可能由B. xenovorans LB400进化而来。利用含硫有机物的降解相关基因,在B. xenovorans LB400和Burkholderia sp.01S基因组中进行相似性搜索,几个相关基因都是存在的。结合Burkholderia sp.01S的蛋白质组数据,LysR型转录调控因子BdhR (LysR-type transcriptional regulator BdhR)的同源基因可能在降解过程中发挥作用。4.初步探究降解基因的水平转移。以自然土壤中的微生物和B. xenovoransLB400为研究对象,调节TDG和降解基因源两个关键因素来模拟降解菌株的水平基因转移过程,目前未筛选到降解菌。在无选择压力TDG的存在下,菌株Burkholderia sp.01S出现了降解能力屏蔽的现象。用复合碳源培养B. xenovoransLB400,发现B. xenovorans LB400对TDG的存在表现出极度的不适应性。本论文的创新性体现为：1.首次报道了伯克霍尔德菌属菌株Burkholderia sp具有降解TDG的能力。2.首次报道了TDG降解菌株Burkholderia sp.01S的全基因组。