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近年来，非注射给药途径的研究成为科研人员关注的热点，其中口服无疑是最方便和最安全的方式之一。多肽和蛋白质药物口服后一般在胃肠道降解成小分子氨基酸后被吸收，在此过程中，其生物学活性也随之消失。因此积极探求提高蛋白质、多肽类药物口服生物利用度的策略越来越被关注，封闭带毒素便是其中的一个研究热点。
封闭带毒素(Zonula Occludens Toxin，ZOT)是霍乱弧菌编码的第二个毒素，通过激活复杂的细胞间级联反应来可逆地调节上皮细胞的通透性，从而影响大分子物质的吸收。ZOT作用可逆、安全，不损伤组织，可能成为一种新颖、安全的多肽口服佐剂。封闭带毒素突变体(cZOT)是ZOT的C端片段，它是封闭带毒素的活性中心，推测其具有与ZOT相似的生物学活性，因此，本研究拟对zot进行基因突变，利用基因工程方法制备出cZOT，将cZOT与蛋白质药物共同口服给药，期望达到促进蛋白质、多肽类药物口服吸收的目的。
本研究内容主要包括以下四部分：
1、zot的克隆及表达通过PCR从霍乱弧菌疫苗基因组DNA中得到zot基因，将其连接到质粒载体pET-32a(+)中，转化大肠杆菌BL21(DE3)后IPTG诱导发酵，在相对分子量65kD处出现目的蛋白表达条带。
2、czot的克隆、表达及诱导条件的优化通过PCR从含有zot基因的质粒载体pET-32a(+).zot中获得czot基因，将其连接到pET-32a(+)中，转化BL21(DE3)后IPTG诱导发酵，在相对分子量32kD处出现目的融合蛋白表达条带，目的蛋白含量较低，于是针对接种量、诱导时机、诱导剂浓度、诱导时间、诱导温度等条件对cZOT蛋白质的诱导表达条件进行优化。优化后蛋白表达量可以提高44％左右，由原来的20％上升至28.85％。
3、cZOT蛋白质的分离纯化诱导后的湿菌体用超声波破菌，破菌上清液经亲和层析后可以得到电泳纯的硫氧还蛋白-cZOT融合蛋白，肠激酶酶切后进行二次亲和层析，得到cZOT蛋白质；HPLC精细纯化进一步提高了蛋白质的纯度。
4、cZOT的生物学活性研究：
选用胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、胰岛素(Insulin)和促血小板生成素(TPO)模拟肽作为代表药物来进行cZOT促进多肽类药物口服吸收实验的研究。
(1)按照800nmol/kg cZOT和500nmol/kgGLP-1的剂量给予小鼠灌胃，不同时间点尾静脉取血测其血糖值变化，结果显示：与GLP-1对照组相比，cZOT+GLP-1组能够有效的降低给药组小鼠的血糖值(p<0.05)，有效时间长达180min。该结果表明，cZOT能够促进GLP-1口服降血糖的作用。
(2)连续给予小鼠700nmol/kg cZOT和5mg/kg。TPO模拟肽5d后，尾静脉取血计数血小板个数，结果显示cZOT+TPO模拟肽给药组能够在第4d～7d促进小鼠血小板的生成(p<0.05)，表明cZOT能够提高。TPO模拟肽口服促血小板生成的作用。
(3)胰岛素和cZOT的浓度范围在400nmol/kg～800nmol/kg时，给药组小鼠的血糖值都能够明显降低，其降糖效果和有效时间随着给药浓度的增加而加强，最长药效可达150min(p<0.05)。对cZOT和胰岛素的活性剂量的研究显示，当胰岛素和cZOT的摩尔比为1:1时，其降糖效果较好。
值得注意的是，当使用相同的方法进行融合蛋白Trx-cZOT促进GLP-1和胰岛素的口服吸收实验时，发现Trx-cZOT具有与cZOT相似的生物学活性，并且，Trx-cZOT的制备过程中，不必进行肠激酶酶切和二次纯化，更为简便、廉价。
通过以上研究，得到了高效表达cZOT的基因工程菌株，同时优化了其表达的条件，为大批量制备cZOT蛋白质提供了可能。在生物活性研究方面，在小鼠体内进行了cZOT促进GLP-1、胰岛素和TPO模拟肽的口服吸收活性的实验，都取得了很好的结果，这些结果表明：cZOT可以促进外源性蛋白质、多肽类药物的口服吸收，我们的研究将为开发安全无毒的新型多肽口服佐剂奠定基础。