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猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumoniae, PCP)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)引起猪的一种呼吸道疾病,该病对养猪生产业造成严重的经济损失。外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)是胸膜肺炎放线杆菌的众多毒力因子之一。本研究主要进行了猪肺组织cDNA文库构建及APPOmpA酵母双杂交阳性克隆子筛选研究,为进一步深入研究OmpA感染猪肺的致病机理奠定坚实基础,主要研究工作如下：1.猪肺组织cDNA文库的构建与鉴定以28日龄健康仔猪的肺组织为材料,Trizol法提取猪肺组织总RNA,分离纯化mRNA,以Invitrogen反转录酶合成cDNA第一链,经LD-PCR扩增得到双链cDNA,再经BD CHROMA SPIN Columns纯化双链cDNA,除去较小的片段,将cDNA与含有DNA激活域(DNA-AD)的酵母表达载体pGADT7-Rec连接,电转化转入大肠杆菌DH10B感受态中,收获克隆子即为猪肺组织cDNA文库,经鉴定最终得到的cDNA文库总容量为1.1×107cfu,插入片段平均长度在1.5Kb左右,文库阳性克隆率为100%,证明该试验成功构建了猪肺组织cDNA文库,为猪肺部致病菌的致病机理方面的研究奠定了基础。2.APP外膜蛋白OmpA酵母双杂交诱饵质粒构建与鉴定以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌5型野毒株基因组全长序列为模板,特异性引物扩增去掉信号肽后的外膜蛋白OmpA片段。将该片段与含有DNA结合域(DNA-BD)的酵母表达载体pGBKT7-Rec连接,获得pGBKT7-OmpA诱饵载体,经PCR和双酶切鉴定均获得大小约为1,100 bp的目的条带；将该诱饵载体通过醋酸锂法转入酵母感受态AH109细胞中,在加有卡那霉素的SD/-Trp营养缺陷性琼脂培养基上收获转化子,即为pGBKT7-OmpA诱饵菌,通过对该诱饵菌进行自激活性检测和细胞毒性检测结果：该诱饵在SD/-Trp/-His、SD/-Trp/-Ade、SD/-Trp/-His/-Ade/-Leu缺陷性固体培养基上均无克隆生长,且在SD/-Trp、SD/-Trp/X-a-gal生长为白色菌落,表明该诱饵菌不能自主激活报告基因HIS3、ADE2和MEL1;在SD/-Trp液体培养基培养22 h后,其菌液OD600值在0.8以上,且与pGBKT7-Rec转化子菌液OD600值无显著差异,表明该诱饵载体对酵母细胞无毒性,可应用于酵母双杂交筛选。3.APP外膜蛋白OmpA与猪肺组织酵母双杂交阳性克隆子筛选以酵母双杂交系统为操作平台,利用杂交基因通过激活报告基因AUR1-C、HIS3、 ADE2和MEL1的表达方法探测蛋白与蛋白之间的相互作用,当携带有DNA激活域的pGADT7-cDNA和携带有DNA结合域的pGBKT7-OmpA在酵母报告菌AH109中相互作用后,结合域和激活域相结合,激活报告基因转录；本实验分别提取出猪肺组织cDNA文库的文库质粒和pGBKT7-OmpA诱饵质粒,采用醋酸锂法将其共同转入酵母AH109感受态细胞中,筛选猪肺组织cDNA文库中与OmpA的互作因子,将转化子均匀涂布在QDO(三缺)培养基上,获得阳性克隆子,再将阳性克隆子均匀涂布在TDO(四缺)培养基上,获得的阳性克隆子依次传代后均匀涂布于TDO/X-a-gal/AbA培养基上,初步确定42个酵母阳性克隆子,扩大培养并提取质粒,经PCR鉴定筛除12个假阳性克隆,对剩余阳性克隆的质粒进行序列测定、比对分析后,所有的阳性克隆子均与野猪混合品种16号染色体上序列号为GI：347618778的片段高度同源,并对该序列预测翻译的3个蛋白进行生物信息学分析。