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越来越多证据表明,磷酸二酯酶（Phosphodiesterase,PDE）在学习和记忆过程中发挥了很大作用,其相应的抑制剂能通过调控细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate,c AMP）含量来改善中枢神经系统退行性疾病所致的学习记忆障碍。因此寻找特异性PDE抑制剂是目前国内外各大药理实验室的研究热点。我们近期的实验结果显示,阿魏酸（ferulic acid,FA）能调节PDE的表达及活性,从而影响生物体的各种代谢。但是FA是如何对PDE进行调控以及面对PDE这样一个庞大的超家族,FA是针对其中某一种亚型发挥特异性调节作用还是发挥非特异性PDE调节作用并不明确。本项目通过现代分子生物学手段明确FA对PDE亚型表达有抑制作用,并对其下游信号通路具有调节作用,并在整体动物学实验上验证FA抗阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）样炎症作用与其对PDE的表达抑制作用密切相关。这些工作将不仅为AD的特异性靶向治疗提供安全有效的天然药物,同时也为FA的药理作用及机制深入研究提供理论支撑。本课题展开了相关的研究工作,包括以下四个部分。第一,运用分子对接的方法模拟FA与PD4B2的相互作用。分子对接结果表明,FA可与包括Tyr233、His234、Met347、Asn395、Phe414、Gln443、和Phe446在内的氨基酸残基发生强烈的相互作用,数据还表明,FA可进入PDE4B2的结合腔,并与氨基酸残基Phe446和Phe414形成ππ相互作用。在FA与氨基酸残基Gln443和His234之间可发现有氢键。FA的构象位于疏水腔区域,表明FA与PDE4B2之间存在静电和疏水性相互作用。分子对接结果从理论上支持了FA对PDE4B酶活性及表达的潜在影响,表明FA可被用作基本结构来设计PDE4抑制剂,应进行进一步的研究来证实该相互作用。第二,体外研究FA对Aβ25-35和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）所致PC12细胞损伤的保护作用。检测了超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性,炎性因子（TNF-α和IL-1β）的表达;检测与抗AD作用密切相关c AMP和Ca2+浓度;另外,检测FA对神经生长因子（nerve growth factor,NGF）对PC12细胞分化的促进作用。实验结果表明FA能显著降低Aβ25-35和LPS所致TNF-α和IL-1β水平的升高,同时升高SOD的表达水平,从而验证了其强大的抗炎和抗氧化功能。FA能够抑制LPS所引起的c AMP水平的降低;通过激光共聚焦技术检测细胞内Ca2+浓度的变化,发现FA能够有效降低LPS所引起的PC12细胞内Ca2+浓度的升高;FA与NGF共孵育,增强NGF诱导PC12细胞的分化作用。初步推测FA有可能对PDE表达具潜在抑制作用。第三,PDE4B可调节细胞内c AMP水平和c AMP/c AMP应答元件结合蛋白（c AMPresponse element binding protein,CREB）通路。进一步研究FA对LPS诱导PC12细胞磷酸二酯酶4B（PDE4B）上调表达及活性的影响,使用激光共聚焦显微镜检测FA对LPS诱导PC12细胞骨架蛋白F-actin变化的影响。我们进一步检测FA对LPS诱导的c AMP特异性PDE活性和细胞炎性因子（TNF-α和IL-1β）及ROS产生的影响;通过实时荧光定量RT-PCR（real-time fluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,Q-PCR）检测LPS诱导PC12细胞PDE4B m RNA表达;通过免疫印迹对PDE4B、CREB和磷酸化CREB（p CREB）的蛋白表达进行检测。FA对LPS所致PC12细胞F肌动蛋白（F-actin）骨架的损伤具有保护作用,明显改善细胞骨架蛋白F-actin的分布和结构。显著抑制LPS诱导的TNF-α、IL-1β及活性氧（reactive oxygen species,ROS）的产生。酶活性试验表明,FA可明显减弱LPS诱导PC12细胞c AMP依赖性PDE酶活性的上调。对PC12细胞PDE4B m RNA的研究表明,FA预处理可减少由LPS诱导的PDE4B m RNA表达上调。免疫印迹表明,FA预处理后,抑制LPS诱导的PDE4B上调作用;对抗LPS诱导的CREB和p CREB下调作用。FA对LPS诱导的PDE4B表达上调的抑制作用及其对下游信号分子CREB和p CREB表达下调的对抗作用可能是其对神经炎症性疾病,比如AD样神经炎症具有治疗作用的一个机制。第四,检测FA对LPS诱导Sprague-Dawley（SD）大鼠学习和记忆缺失的保护作用;探讨FA对LPS诱导海马神经细胞损伤的保护作用及机制?在本研究中,Morris水迷宫试验检测FA对抗LPS诱导的大鼠学习和记忆缺失作用,苏木精-伊红染色（Hematoxylin-eosin staining,HE）检测FA对LPS损伤大鼠大脑皮层和海马神经元的组织病理学保护作用?免疫荧光法检测FA对LPS损伤海马神经元细胞骨架蛋白β-tubulin的保护作用?为阐明FA对LPS诱导的海马神经元的保护作用,检测SOD活性;Q-PCR检测FA抗LPS诱导的IL-1β?caspase-1?Nod样受体蛋白3（Nod like receptor protein,NLRP3）和PDE4B的m RNA表达作用;免疫印迹法检测PDE4B、NLRP3和CREB及p CREB蛋白的表达?免疫组织化学染色法检测FA对LPS诱导大鼠海马神经元CA1?CA2和CA3区PDE4B蛋白表达的影响?Morris水迷宫试验表明FA预处理对抗LPS诱导的大鼠学习记忆功能障碍;HE染色显示,预先给予不同剂量FA可以减轻腹腔注射LPS诱导的SD大鼠海马神经元损伤;与LPS组相比,FA预处理组大鼠海马神经元β-tubulin蛋白表达增加;FA预处理显著维持大鼠大脑皮层和海马神经元中被LPS抑制的SOD的活性;FA预处理显著抑制LPS诱导的IL-1β?capase-1?NLRP3和PDE4B的m RNA水平的增加?Western蛋白印迹分析表明,相较于LPS组,FA预处理组的CREB和p-CREB的表达增加,同时抑制LPS诱导的大鼠海马神经元中PDE4B和NLRP3的表达;免疫组化染色结果显示,FA预处理显著抑制了LPS诱导的海马神经元中CA1?CA2和CA3区PDE4B表达的上调?FA对LPS诱导的大鼠学习和记忆损伤以及海马神经元损伤发挥保护作用。FA的神经保护作用与其抗炎,抗氧化作用密切相关;FA抑制LPS诱导的PDE4B上调并对抗LPS对CREB和p CREB的下调作用,FA可作为AD样神经炎性疾病的治疗药物。