CD4～+CD25～+调节性T细胞和白血病的临床与实验研究

• 作 者: 张帆
• 出 处: 山西医科大学
• 发表日期: 2007年01期
• 关键词: C57BL/6小鼠 CD4~+CD25~+调节性T细胞 Foxp3 mRNA 免疫疗法

近年来研究证实许多肿瘤相关抗原是正常的自体成分，而不是突变基因的异常产物，表明肿瘤免疫在一定程度上是一种自身免疫。CD4⁺CD25⁺调节性T细胞（CD4⁺CD25⁺regulatory T cell，CD4⁺CD25⁺Treg）能通过“主动”方式抑制免疫系统对自身和外来抗原的应答，在维持自身免疫耐受中发挥重要作用，因此可能具有抑制肿瘤免疫的作用。CD4⁺CD25⁺Treg为研究肿瘤发展和免疫抑制的关系提供了一条新的途径。1995年Sakaguchi等人首次报道在正常小鼠的外周血CD4⁺T细胞中约有5％～10％的细胞持续高表达CD25分子（IL-2受体α链），同时这一亚群细胞是CD45RB分子低表达的，称之为CD4⁺CD25⁺Treg。CD4⁺CD25⁺Treg是一群独特的专职抑制细胞，其表面表达CD4，CD25（IL-2Ra）、CTLA-4（T淋巴细胞毒性相关抗原-4）、GITR（肿瘤坏死因子受体）、Foxp3（叉头翼状螺旋转录因子）等。2003年Rudensky等研究小组证明Foxp3在CD4⁺CD25⁺Treg细胞上特异性表达，且Foxp3在Treg细胞的发育和功能上是必需的。目前关于CD4⁺CD25⁺Treg特异的标记分子Foxp3在人的研究刚刚起步，由于Foxp3荧光单抗于2004年底才由美国eBioscience公司开发并销售，多数研究均采用流式细胞仪检测CD4、CD25两个指标，然后用RT-PCR检测Foxp3 mRNA的表达水平，但Foxp3 mRNA的表达水平并不能真实反映其蛋白水平，因此本课题采用2004年新推出的人调节性T细胞检测试剂盒用流式细胞仪同时检测CD4、CD25、Foxp3三个指标，可以反映Foxp3蛋白表达水平，以进一步明确白血病患者体内Foxp⁺CD4⁺CD25⁺Treg细胞的变化。CD4⁺CD25⁺Treg通过抑制自身反应性T细胞来控制自体免疫反应，但过度抑制肿瘤反应性淋巴细胞会导致病人失去自身的抗肿瘤免疫反应，研究发现CD4⁺CD25⁺Treg不仅能够抑制CD8⁺T细胞的功能，还可抑制CD4⁺T细胞和NK细胞的抗肿瘤活性。Wolf和Ormandy等发现在卵巢癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌等多种肿瘤患者外周血和肿瘤局部CD4⁺CD25⁺Treg比例增高，并且数量与病人肿瘤进展程度和预后相关。CD4⁺CD25⁺Treg细胞的研究多集中于实体瘤，而恶性血液病CD4⁺CD25⁺Treg细胞的研究较少。尤其急性白血病中CD4⁺CD25⁺Treg细胞的检测仅有一篇，即王兴兵等报道在AML病人体内CD4⁺CD25⁺Treg含量显著增高，但他未作Foxp3表达的检测。本研究将检测急性白血病患者外周血CD4⁺CD25⁺Treg及CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞的变化，进一步阐明CD4⁺CD25⁺Treg与白血病发病的关系。肿瘤患者外周血、淋巴结和肿瘤局部CD4⁺CD25⁺Treg细胞数量增加，然而目前对于肿瘤患者CD4⁺CD25⁺Treg细胞增高的机制还不明了，是CD4⁺CD25⁺Treg细胞的升高导致了肿瘤的发生，还是肿瘤的出现引起了CD4⁺CD25⁺Treg细胞的升高还有待进一步探讨。本研究拟通过小鼠体内外实验观察是否肿瘤的发生促进了CD4⁺CD25⁺Treg增高。白血病是一类起源于造血干细胞的克隆性恶性肿瘤，白血病的传统治疗通常是联合化疗、放疗、造血干细胞移植，但这些治疗同时也带来很多严重的并发症，还有罹患第二肿瘤的危险性，并且复发率很高。近年来白血病的免疫治疗逐渐成为白血病治疗中的热点，但是肿瘤抗原特异的免疫治疗效果目前并不十分令人满意，可能与肿瘤细胞能通过某种机制逃避免疫系统的攻击有关。现已证实CD4⁺CD25⁺Treg细胞可以抑制肿瘤特异性免疫反应，使肿瘤细胞易于生长和转移，对免疫治疗起负调控作用，是肿瘤免疫抑制的又一机制。为了探讨白血病发展中CD4⁺CD25⁺Treg的负性调节作用。本课题拟研究以下内容：①检测急性白血病患者外周血CD4⁺CD25⁺Treg含量。②通过小鼠体内外实验观察肿瘤是否可以诱导CD4⁺CD25⁺Treg上调。从而探讨白血病发生发展机制，并最终为白血病免疫治疗寻找新的方向。第一部分：急性白血病患者CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的检测及意义目的：研究急性白血病患者外周血CD4⁺CD25⁺Treg亚群的变化，探讨其在白血病发病中的意义。方法：选取山西医科大学第二医院血液科2005年9月-2006年5月急性白血病患者（AL）32例，均为初发化疗前的住院患者，男性20例，女性12例，患者平均年龄53．6岁。全部急性白血病患者均经临床、骨髓细胞学、免疫分型检查确诊。对照组为我院体检健康者16例，男10例，女6例，平均年龄48．2岁。采集外周血，用流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺Treg细胞含量。操作步骤按照“人调节性T细胞检测试剂盒”说明书：用人淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），在100μl PBMC中加20μl FITC标记的抗人CD4抗体和APC标记的抗人CD25抗体混合液标记细胞膜表面CD4、CD25分子，然后用PE标记的抗人Foxp3抗体标记胞浆Foxp3分子，流式细胞仪检测CD4⁺CD25⁺Treg及CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例。同时应用ELISA法检测患者和健康对照血清TGF-β和IL-10水平，并分析了白血病患者血清中IL-10和TGF-β水平与CD4⁺CD25⁺Treg的相关性，本研究获得的数据均输入计算机，利用SPSS软件完成统计计算工作。淋巴细胞的百分比以mean±SD表示，组间均数比较采用独立样本t检验。结果：急性初发白血病患者外周血的CD4⁺CD25⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例明显高于正常对照（3．96±1．86）％vs（2．08±1．63）％（P＜0．01），与文献报道一致。此外本研究首次发现急性白血病患者外周血CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg细胞占CD4⁺T细胞的比例显著高于正常对照（3．22±1．01）％vs（0．83±0．72）％（P＜0．01），由于CD4和CD25分子不仅表达CD4⁺CD25⁺Treg细胞上，同时也表达于活化的效应T细胞上，而Foxp3是CD4⁺CD25⁺Treg细胞的特异性标记分子，因此CD4⁺CD25⁺Foxp3⁺Treg能更好地反映机体免疫抑制功能。本研究表明高表达Foxp3的CD4⁺CD25⁺Treg细胞是急性白血病患者免疫功能低下的原因之一。另外我们意外发现急性白血病患者外周血CD4⁺Foxp3⁺T细胞比例显著高于正常对照（14．9±2．92）％vs（5．68±1．21）％（P＜0．001），但是这群细胞与CD4⁺CD25⁺Treg之间的关系有待于进一步的研究。本研究还研究了白血病患者血清中IL-10和TGF-β水平与CD4⁺CD25⁺Treg的相关性，结果显示急性白血病患者外周血CD4⁺CD25⁺Treg细胞含量与血清TGF-β、IL-10表达水平呈正相关。结论：本研究结果证明：①急性初发白血病患者外周血的CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例显著高于正常对照，提示CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例增高导致白血病患者抗肿瘤免疫功能低下，使肿瘤易于生长和转移。同时提示下调CD4⁺CD25⁺Treg数量及功能将有助于提高机体抗肿瘤免疫，减轻肿瘤负荷。②急性白血病患者外周血CD4⁺CD25⁺Treg细胞含量与血清IL-10和TGF-β表达水平均呈正相关，说明IL-10和TGF-β都在CD4⁺CD25⁺Treg细胞抑制效应中发挥重要作用。这些研究将为以CD4⁺CD25⁺Treg为靶点的免疫调控策略提供有益的启示。第二部分：白血病细胞在小鼠体内外诱导CD4⁺CD25⁺调节性T细胞增殖的实验研究目的：通过小鼠体内外实验观察白血病细胞及其分泌的可溶性物质是否可以诱导CD4⁺CD25⁺Treg的分化增殖，一方面检测荷瘤小鼠体内CD4⁺CD25⁺调节性T细胞的变化，另一方面观察来源于C57BL／6小鼠的红白血病瘤细胞株FBL3培养上清液对这类细胞的影响，本研究旨在对白血病发病过程中CD4⁺CD25⁺Treg细胞升高的机制进行初步探索，以期为肿瘤发生发展中对CD4⁺CD25⁺Treg的认识及调控提供有益的资料，为临床白血病的诊断和治疗提供实验依据。方法：①小鼠体内实验：用含10％胎牛血清（FBS）的RPMI1640培养液大量培养来源于C57BL／6小鼠的红白血病瘤细胞系FBL3，5％CO₂、37℃、饱和湿度条件下培养。收集处于对数生长期的FBL3细胞，PBS洗涤3次，调整活细胞浓度为2×10⁷／ml。选6-8周龄雄性C57BL／6小鼠共44只，随机分组，将模型组小鼠（n=22）腹腔注射红白血病瘤细胞系FBL3 1ml／鼠（含FBL3细胞2×10⁷），对照组小鼠（n=22）于腹腔注射0．01M PBS 1ml／鼠；成模后分别取肿瘤组织以及肝、脾、肾等病理切片鉴定；流式细胞仪检测小鼠外周血、脾脏及瘤组织CD4⁺CD25⁺Treg细胞含量：C57BL／6小鼠摘眼球取血置于一抗凝管，然后常规颈椎脱臼处死，无菌取出脾脏及瘤组织，用100目不绣钢目制备脾细胞悬液和肿瘤细胞悬液，分离外周血、脾脏和肿瘤淋巴细胞，调整活细胞浓度为1×10⁷／ml。每个样品约1×10⁶个细胞（100μl），分别加入FITC-anti-mouse CD4 1ul，PE-anti-mouse CD25 2．5ul，4℃避光孵育30分钟，流式细胞仪检测淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺Treg比例；RT-PCR检测小鼠脾脏及瘤组织CD4⁺CD25⁺Treg细胞特异性标记Foxp3 mRNA的表达。Foxp3引物：上游引物序列为5＇CAGCTGCCTACAGTGCCCCTAG 3＇，下游引物序列为5＇CATTTGCCAGCAGTGGGTAG 3＇。内参HPRT引物：上游引物序列为5＇GGTGAAGGTCGGTGTCAACG3＇，下游引物序列为5＇CAAAGTTGTCATGGATGACC3＇。所扩Foxp3片断约340bp。常规颈椎脱臼处死小鼠，无菌取出脾脏及瘤组织，用UNIQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取RNA，用AMV逆转录酶逆转录后进行PCR反应。以未接种瘤细胞的正常同品系小鼠20只做对照组测定相应指标。②体外实验：FBL3细胞培养上清液对小鼠脾脏调节性T细胞的作用检测。首先制备FBL3细胞培养上清液，常规颈椎脱臼处死正常C57BL／6小鼠，无菌取脾并制备脾脏淋巴细胞悬液，取6孔板分四组：第一组为空白对照：0．5 ml小鼠脾脏淋巴细胞+1ml 1640培养液。第二组：0．5 ml小鼠脾脏淋巴细胞+1ml FBL3细胞培养上清液。第三组：0．5ml小鼠脾脏淋巴细胞+CD3单抗（终浓度为2μg／ml）+1ml 1640培养液。第四组：0．5 ml小鼠脾脏淋巴细胞+CD3单抗（终浓度为2μg/ml）+0．5 ml FBL3细胞培养上清液+0．5ml 1640培养液。培养72小时后用流式细胞仪检测各组中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞含量。同时RT-PCR检测各组淋巴细胞中CD4⁺CD25⁺调节性T细胞特异性标记Foxp3 mRNA的表达。实验重复3次。统计分析同第一部分。结果：小鼠体内实验结果显示正常小鼠血液、脾脏的CD4⁺CD25⁺Treg细胞占淋巴细胞比例分别为（4．15±1．17）％和（3．82±1．07）％，与文献报道一致。荷瘤小鼠CD4⁺CD25⁺Treg亚群在外周血、脾脏及肿瘤组织之间的分布有显著性差异，其中脾脏中CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例最高，而肿瘤组织中最低。荷瘤鼠外周血CD4⁺CD25⁺Treg占淋巴细胞比例与正常鼠比较无统计学差异（P＞0．05），但荷瘤鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg占淋巴细胞比例显著高于正常对照（（16．2±0．56）％，（3．82±1．07）％，P＜0．01），同时荷瘤鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg占总CD4⁺T细胞比例也明显高于正常小鼠（（25．48±3．26）％，（20．23±2．07）％，P＜0．05）。而CD4⁺CD25⁺Treg占总CD4⁺T细胞比例在正常鼠和荷瘤鼠之间无差别，均为脾脏组织明显高于外周血（P＜0．01）。RT-PCR检测结果发现与正常小鼠脾脏组织Foxp3 mRNA的表达相比较，荷瘤小鼠脾脏组织Foxp3 mRNA的表达量明显增加（P＜0．01），而瘤组织中Foxp3mRNA的表达量较低，与流式细胞仪检测结果相符。体外实验表明小鼠红白血病瘤细胞FBL3培养上清液能够使正常小鼠CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例增加，而且在CD3单抗刺激的同时加入FBL3培养上清液后，小鼠脾脏中CD4⁺CD25⁺Treg细胞仍呈同步增加。RT-PCR检测发现其特异性标记分子Foxp3 mRNA的表达在加入FBL3培养上清液诱导后也明显增加。表明这种白血病细胞上清液中可能存在某种免疫调节因子促使小鼠脾脏CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例上调。结论：①流式细胞仪检测白血病动物模型中脾脏的CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例显著高于正常对照，而外周血CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例与正常对照组相似。②荷瘤鼠CD4⁺CD25⁺Treg亚群在外周血、脾脏及肿瘤组织之间的分布有显著性差异，其中脾脏中CD4⁺CD2⁵+Treg细胞比例最高，而肿瘤组织中最低。③RT-PCR检测荷瘤鼠脾脏Foxp3 mRNA的表达明显高于正常对照组，肿瘤组织表达较低，与流式结果相符。④小鼠红白血病瘤细胞FBL3培养上清液促进小鼠淋巴细胞CD4⁺CD25⁺Treg比例升高，同时其特异性标记分子Foxp3 mRNA的表达明显增加。本研究通过体内外试验证明了肿瘤以及肿瘤微环境诱导了CD4⁺CD25⁺Treg细胞的增殖，说明是肿瘤的发生促进了CD4⁺CD25⁺Treg增高。为阐明肿瘤患者CD4⁺CD25⁺Treg细胞增高机制的研究提供了可靠的实验依据，同时也为深入理解CD4⁺CD25⁺Treg细胞在肿瘤发生发展中的作用和肿瘤发生发展的机制以及肿瘤防治方法的改进提供依据。综上所述本研究结果表明①急性白血病患者CD4⁺CD25⁺Treg细胞比例增高可能使患者免疫功能受损。②白血病细胞及其分泌的可溶性物质可诱导CD4⁺CD25⁺Treg细胞的增殖，说明肿瘤的发生可促进CD4⁺CD25⁺Treg增高。这些发现不仅可以更好的解释白血病患者免疫功能低下、患病宿主预后较差的事实，而且提示CD4⁺CD25⁺Treg细胞可以成为治疗肿瘤的一个新的靶点，一方面通过清除CD4⁺CD25⁺Treg或下调其活性可显著增强抗瘤活性，另一方面治疗性疫苗的疗效可通过减低CD4⁺CD25⁺Treg的功能获得更进一步的提高，从而增强已经存在的针对各种恶性肿瘤的瘤苗的效应。本研究初步揭示了白血病患者免疫功能受损的机制，为临床白血病的发病机制及有效的肿瘤免疫治疗等研究奠定了基础。