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第一部分miR-1269a在人食管癌组织和细胞系中的表达及对食管癌细胞生物学功能的影响 目的：研究miR-1269a在食管癌组织和食管癌细胞系中的表达及对食管癌细胞增殖、迁移、侵袭、转移能力的影响。 方法： 1 利用small RNA测序技术在3对食管正常上皮组织和食管癌组织进行测序分析。 2 分别提取食管癌组织、癌旁组织及食管癌细胞系的总RNA，采用Realtime PCR的方法检测miR-1269a的表达情况。 3 应用MTS法、Transwell迁移、Matrigel侵袭和划痕愈合实验检测过表达/抑制miR-1269a表达后对食管癌细胞增殖活性、侵袭和迁移能力的影响。 结果： 1. 从正常食管上皮组织及食管癌组织中基因测序结果中鉴定出4个表达具有严重差异的miRNA。其中miR-1269a已经在肝癌和直肠癌中被报道，但是在食管癌中尚未被报道。我们选取miR-1269a作为下列实验的研究对象。 2. Realtime PCR实验结果显示，与食管癌旁组织相比，miR-1269a在食管癌组织中的表达水平明显增加(P＜0.05)。 3. Realtime PCR实验结果显示，与正常食管上皮细胞相比，KYSE30、KYSE180 和 TE1 细胞中 miR-1269a 的表达水平显著升高(P＜0.05)，而KYSE150、Eca109和KYSE410细胞中miR-1269a的表达水平略有升高(P＜0.05)。选取其中的KYSE30、KYSE180和Eca109细胞系进行后续的实验。 4. MTS法检测结果显示，过表达miR-1269a基因后能促进食管癌细胞KYSE30、KYSE180和Eca109的增殖能力。反之，抑制miR-1269a基因后能抑制食管癌细胞 KYSE30、KYSE180 和 Eca109 的增殖能力(P＜0.05)。 5. Transwell小室实验结果显示，过表达miR-1269a基因后能促进食管癌细胞KYSE30、KYSE180和Eca109的迁移和侵袭能力。反之，抑制miR-1269a基因表达后能抑制食管癌细胞KYSE30、KYSE180和Eca109的迁移和侵袭能力(P＜0.05)。 第二部分miR-1269a通过靶向调控SOX7促进食管癌发生发展机制的研究 目的：研究miR-1269a通过靶向调控SOX7进而影响Wnt/β-catenin信号通路促进食管癌发生发展的机制。 方法： 1 过表达/抑制 miR-1269a 表达后，应用 Western blot 方法检测KYSE30、KYSE180和Eca109中SOX6和SOX7的表达情况，应用Realtime PCR方法检测SOX6和SOX7 mRNA的表达情况。 2 分别提取食管癌组织、正常组织及食管癌细胞系的总RNA，采用Realtime PCR的方法检测SOX6和SOX7mRNA的表达情况。 3 双荧光素酶报告系统验证SOX7为miR-1296a的靶基因。 4 应用MTS法，Transwell迁移，Matrigel侵袭和划痕愈合实验检测过表达miR-1269a组、过表达SOX7组以及过表达miR-1269a同时过表达SOX7后对食管癌细胞增殖活性，侵袭和迁移能力的影响。 5 Western blot方法检测过表达SOX7对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。 6 Western blot方法检测过表达/抑制miR-1269a对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。 7 Western blot方法检测过表达miR-1269a、过表达SOX7以及过表达miR-1269a同时过表达SOX7后对Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白表达的影响。 8 免疫组化方法检测SOX7蛋白在食管癌组织中的表达，统计分析miR-1269a表达水平与SOX7蛋白表达水平的相关性。 结果： 1. Western blot结果显示，过表达miR-1269a后，SOX6和SOX7蛋白的表达水平降低（P＜0.05 )；抑制miR-1269a表达后，SOX6和SOX7蛋白的表达升高（P＜0.05 )。Realtime PCR 实验结果显示，过表达miR-1269a后，SOX6 和SOX7 mRNA的表达没有发生明显变化（P＜0.05 )；抑制miR-1269a表达后，SOX6和SOX7 mRNA的表达也没有显著变化（P＜0.05 )。 2. Realtime PCR实验结果显示，与食管癌癌旁组织相比，SOX6 和SOX7 mRNA在食管癌组织中的表达均明显降低(P＜0.05)。同时，与食管癌正常细胞相比，SOX6 和SOX7在食管癌细胞的表达水平均明显降低(P＜0.05)。 4. 双荧光素酶报告基因检测揭示HEK293T细胞中，miR-1296a过表达显著减弱与野生型SOX7萤光素酶的活性，但未能降低突变型SOX7萤光素酶活性(P＜0.05)。 5. MTS检测结果显示，过表达miR-1269a后食管癌细胞增殖活性增强(P＜0.05)。过表达SOX7组食管癌细胞增殖活性降低(P＜0.05)。过表达miR-1269a同时过表达SOX7后，相较于单独过表达miR-1269a组，食管癌细胞增殖活性降低，相较于单独过表达SOX7组，食管癌细胞增殖活性升高(P＜0.05)。 6. Transwell小室实验结果显示，过表达miR-1269a组食管癌细胞迁移和侵袭活性增加(P＜0.05)，过表达SOX7组食管癌细胞迁移和侵袭活性降低(P＜0.05)，过表达miR-1269a同时过表达SOX7组后，相对于单独过表达miR-1269a组，食管癌细胞迁移和侵袭活性降低，相对于单独过表达SOX7组，食管癌细胞迁移和侵袭活性升高(P＜0.05)。 7. Western blot法分析结果显示，过表达SOX7可以抑制食管癌细胞Wnt/β-catenin信号通路，并且β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表达水平降低，磷酸化的β-catenin表达升高(P＜0.05)。 8. Western blot 法分析结果显示，过表达 miR-1269a 后可激活Wnt/β-catenin信号通路，并且β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表达水平升高，磷酸化的β-catenin表达量降低(P＜0.05)。抑制miR-1269a表达可降低Wnt/β-catenin信号通路的活性，并且β-catenin、cyclin D1和c-Myc蛋白表达量降低，磷酸化的β-catenin表达水平升高(P＜0.05)。 9. Western blot法分析结果显示，相对于单独过表达miR-1269a，过表达miR-1269a同时过表达SOX7后，会抑制miR-1269a对食管癌细胞Wnt/β-catenin信号通路的激活作用，Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白β-catenin、cyclin D1和c-Myc表达水平降低，磷酸化的β-catenin蛋白表达水平升高(P＜0.05)。 10. 免疫组织化学检测结果显示，在42例食管癌标本中35例SOX7蛋白表达下降(P＜0.05)。在这些例病例中，miR-1269a与SOX7的表达呈负相关(P＜0.05)。 第三部分 过表达miR-1269a对食管癌细胞裸鼠种植瘤的影响 目的：探究miR-1269a在体内对食管癌增殖能力的影响。 方法： 1 构建稳定过表达miR-1269a的食管癌细胞，然后进行裸鼠皮下食管癌细胞种植瘤实验，并且观察种植瘤的生长状况。 2 应用免疫组织化学法检测裸鼠种植瘤组织中SOX7、β-catenin、Ki67、CD34的表达情况。 结果： 1. 与对照组相比，过表达miR-1269a组的裸鼠皮下种植瘤的增长速度明显增加(P＜0.05)。 2. 免疫组织化学法分析结果显示，过表达miR-1269a组的裸鼠皮下种植瘤组织中SOX7表达明显低于对照组(P＜0.05)。β-catenin、Ki67和CD34的表达水平明显高于对照组(P＜0.05)。 结论：食管癌组织和细胞中miR-1269a表达水平明显上调，并且在体内外均能促进食管癌细胞的增殖活性，在体外还能促进食管癌细胞的迁移和侵袭能力，通过直接靶向抑制 SOX7 的 3-UTR 的表达可激活Wnt/β-catenin信号通路。