烟草花叶病毒模板指导的矿化与多级组装调控

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近年来,以病毒为操纵基元指导的纳米材料合成和组装受到广泛关注,成为纳米生物学的一个重要研究方向,在生物成像、生物医学、纳米电子学及催化等诸多领域有着极具潜力的应用。其中,烟草花叶病毒(TMV),作为最早被发现和研究的病毒,已被广泛用于制造新型纳米材料与纳米器件。然而,稳定性不够、特定功能化困难和可控性不足等一些缺点限制了以TMV为基础的研究应用的进一步发展。本论文以TMV为主要操作对象,结合基因工程手段与纳米技术进行矿化合成和可控组装研究工作。我们实现了TMV蛋白管内孔道金纳米材料的空间选择性矿化,多功能化TMV模板制备以及DNA支架-TMV纳米管多级复合结构的精确构筑,从多种角度拓展TMV病毒系统的研究和应用,为制备新型功能化生物纳米材料提供一种有效途径。具体研究内容包括以下三部分:  1.我们将TMV蛋白亚基肽链序列上的第103位苏氨酸突变为半胱氨酸,利用大肠杆菌作为表达来源进行重组蛋白T103Ccp的表达和纯化,获得T103Ccp。T103Ccp可以自组装形成TMV样蛋白管,而且相邻亚基间形成的二硫键将提高蛋白管的稳定性。同时,蛋白管内表面排列的半胱氨酸巯基基团具有强烈的金属螯合作用,可以作为化学吸附中心促进位点特异性成核。通过成核和生长调控,我们不仅实现金纳米棒和金纳米颗粒链在其狭窄孔道内的空间选择性矿化,并且展示了金纳米颗粒成链过程中粒径和密度的可控性。  2.发展了一种共组装策略来实现不同来源和性质的TMV材料的优化组合,获得具有良好稳定性和均一性的TMV核蛋白管。菌源重组蛋白T103Ccp虽然可以在形成的蛋白管结构中引入二硫键而提高稳定性,但因菌源异质性而无法包装基因组RNA,组装长度无法控制。植物源TMVcp具有良好的重构组装能力,在基因RNA引导下,利用其协同作用有望实现T103Ccp的掺杂,从而获得长度均一,更加稳定的纳米管。通过琼脂糖凝胶电泳,非还原性SDS-PAGE和透射电镜表征,我们对不同比例共组装产物进行了研究,证明了策略的可行性。获得的TMV嵌合体不仅具有统一的300 nm长度,还拥有T103Ccp亚基间形成二硫键所带来的结构稳定性。  3.实现DNA与蛋白质的多级杂化可控构筑具有重要意义。我们以24HBorigami为支架,在其表面特定位置设计具有序列特异性的DNA捕获链杂交客体 RNA的3末端序列,以实现RNA的位点选择性锚定。加入TMVcp,在RNA引导下进行原位组装,实现TMV核蛋白管在DNA支架表面定向装配。而且,我们构建了三种不同长度的RNA进行蛋白质化学计量学的精确调控,分别得到长约30 nm、55nm和85 nm的TMV纳米管。因此,基于病毒装配机制与DNA支架的可编程性,我们展示了DNA origami-病毒纳米管三维复合结构的精确组织与调控,为实现DNA-蛋白质多级杂化组装体的定制构筑提供新的策略。
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