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漆酶是一种含铜的多酚氧化还原酶,真菌漆酶具有降解木质素、去除酚类和芳胺类化合物毒性的作用,在环境保护、造纸工业、食品工业上具有广阔的应用前景。
本文对白腐真菌TR16号的产酶诱导剂选择、漆酶的分离纯化和酶学性质及其在染料、农药降解、木材加工的应用性质进行探讨和研究,结果如下:
1.在优化后的培养基中分别添加Cu2+、鞣酸、愈创木酚、阿魏酸、邻甲苯胺和ABTS作为漆酶的诱导剂。于培养4天后各添加1mmol/LCu2+,1mmol/LABTS、1mmol/L阿魏酸、1mmol/L邻甲苯胺,从培养第5天开始检测漆酶活性,得出Cu2+对TR16号漆酶诱导效果最为明显,与对照相比,漆酶活性提高了10倍,漆酶活性最高可达23000U/L;阿魏酸、邻甲苯胺、鞣酸、愈创木酚对前期TR16号的生长及漆酶产生有抑制作用。
2.采用超滤浓缩、DEAESepharoseFastFlow柱层析和SephadexG100凝胶柱层析对白腐真菌TR16漆酶发酵液进行分离纯化,得到电泳纯漆酶。SDS-PAGE电泳结果显示,该漆酶表观分子量为60KDa。Native-PAGE鉴定该漆酶由一种同工酶组成,为单体酶。试验结果表明,该漆酶的最适反应温度为50℃,与ABTS的最适反应pH为3.5,Km为0.44mmol/L;在pH5.5~pH7.5之间较稳定。金属离子Mg2+和Mn2+对漆酶酶活有促进作用,而Cu2+、CO2+、Ca2+、Al3+和Zn2+则对酶活有较强的抑制作用,Tris和Tween80则对该漆酶活性具有促进作用。
3.白腐真菌TR16号漆酶对偶氮类染料(甲基红、直接黄、直接耐晒绿、直接黄棕、直接大红、还原嫩黄),葸醌类染料(活性艳蓝、酸性榄绿、直接墨绿),靛族染料(酸性靛蓝)和三苯甲烷类染料(孔雀石绿、酸性品红、溴甲酚绿、结晶紫、溴酚蓝、酸性紫)有一定的降解能力,其中对部分偶氮类染料(甲基红、直接黄棕),蒽醌类染料(活性艳蓝、酸性蓝绿)和三苯甲烷类染料(孔雀石绿、溴甲酚绿、溴酚蓝)的降解显著,脱色率可分别达到80%以上,对酸性靛蓝的脱色率可达53%。利用壳聚糖交联和海藻酸钠包埋固定化方法对漆酶进行固定化,所获得的固定化漆酶的pH和热稳定性较游离酶高,用固定化漆酶对染料进行降解,固定化漆酶降解能力较游离酶要低10%—20%。本实验用纯化后的漆酶(8U/ml)对沙丁胺醇(100bpm)、呋喃丹(100bpm)及五氯苯酚(100bpm)进行漆酶的降解实验,处理时间为24h。高效液相检测条件分别为:五氯苯酚(甲醇:磷酸二氢钠缓冲液=95:5),呋喃丹(甲醇:水=45:55),沙丁胺醇(乙腈:甲醇=1:1)。高效液相色谱检测显示漆酶对沙丁胺醇和呋喃丹并没有作用效果,五氯苯酚被TR16漆酶所降解。
4.用白腐真菌TR16号漆酶作自由基引发剂来处理木材生产人造板,每份试样反应温度为30℃,反应过程中持续通入氧气,且不断搅拌。在热压温度为122(±5℃)—130(±5℃)℃处理条件下,结果显示试件的结合强度大于0.5Mpa,比重达到1,含水率小于1%,表面不掉碎屑,外观较好,达到刨花板的生产指标要求,但吸水膨胀率较大,达15%,而指标要求为8%。