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甘丙肽(Galanin,GAL)是脑内一个易被诱导的肽类之一,目前已经克隆出三个甘丙肽受体,分别为GalR1、GalR2和GalR3。近年来甘丙肽的抗惊厥作用已受广泛关注,但是对于甘丙肽受体在其中发挥的作用研究的不多。本实验用大鼠锂一毛果芸香碱模型来模拟人颞叶癫痫,观察疾病的发生发展过程中甘丙肽及其受体的变化,及可能的变化的机制。
1、毛果芸香碱颞叶癫痫大鼠模型的建立
我们用氯化锂-毛果芸香碱建立了颞叶癫痫大鼠模型,根据体重给大鼠腹腔注射LiCl,18-20小时后注射pilocarpine,密切观察大鼠行为学变化,直至出现癫痫持续状态(SE),SE后45-60分钟腹腔一次性注射地西泮注射液(20mg/kg),降低实验大鼠的死亡率。急性期大鼠出现癫痫持续状态,变性的神经元可出现在大脑皮层、海马、丘脑、梨形皮质和下丘脑等;慢性期大鼠出现癫痫自发性发作,变性的神经元主要出现在梨形皮质,同时海马伴有胶质细胞的反应性增生及排列紊乱。
2、甘丙肽及其受体的mRNA水平在颞叶癫痫大鼠模型中的变化
癫痫持续状态后24小时(急性期)、7天(潜伏期)和8周(慢性期),提取模型和对照大鼠的脑标本RNA,利用实时定量PCR技术进行相对定量,GAPDH为内参。
2.1、海马结构
我们发现在颞叶癫痫模型大鼠的急性期,背侧海马和腹侧海马galanin、GalR1和GalR3的mRNA水平上调,而在潜伏期和慢性期GalR1的mRN,A水平仅在背侧海马有上调。腹侧海马潜伏期galanin的mRNA水平也是上调的,慢性期恢复到正常水平。我们的结果提示在海马,galanin的抗惊厥作用可能主要是通过GalR1和GalR3。
2.2、其他脑区
顶叶皮层SE后24小时galanin、GalR1、GalR2和GalR3的mRNA水平上调,慢性期则恢复正常。与颞叶癫痫密切相关的梨形皮层,在急性期galanin和GalR3的mRNA水平上调,在潜伏期GalR1的mRNA水平是下调的,在慢性期galanin的mRNA水平是上调的。
3、甘丙肽的免疫组化染色在颞叶癫痫大鼠模型中的变化
3.1、海马结构
利用TSA免疫荧光技术,我们发现对照大鼠海马各区均有galanin免疫反应阳性的纤维和DpH免疫反应阳性的纤维分布,两者有部分是共存的。海马内没有见到galanin免疫反应阳性的细胞。
模型大鼠癫痫持续状态后24小时,海马内galanin免疫反应阳性的纤维染色几乎全部消失,但是DβH代表的去甲肾上腺素能的纤维仍然存在。海马CA3区出现galanin免疫反应阳性的树突样染色,同时海马齿状回、CA1和CA3区可见galanin免疫反应阳性的细胞,这些细胞与NeuN共标,部分与Parvalbumin共标,部分与Calretinin共标,部分与Calbindin-D-28K共标,不与FJB共标,提示可能为非变性的中间神经元。
模型大鼠癫痫持续状态后7天,海马内galanin免疫反应阳性的纤维染色逐渐出现,但是仍较稀少,海马内出现的galanin免疫反应阳性的细胞逐渐减少。癫痫持续状态后8周,galanin免疫反应染色模型组与对照组大鼠没有明显区别。
3.2、其他脑区
在模型大鼠急性期,大脑皮层、梨形皮质galanin免疫反应阳性的纤维染色减少,丘脑室旁核、丘脑前背侧核、梨形皮层、外侧杏仁核、中缝背核可见到galanin免疫反应阳性的细胞,大脑皮层、梨形皮质可见到异常的galanin免疫反应阳性的树突样染色。潜伏期galanin免疫反应染色部分恢复,仅梨形皮层的galanin免疫反应阳性的纤维仍分布杂乱,且一直持续到慢性期。丘脑室旁核内的galanin免疫反应阳性的细胞,与NeuN共标,部分与Calretinin共标,部分与Calbindin-D-28K共标,不与Parvalbumin、FJB共标,提示可能为Calbindin-D-28K或Calretinin阳性的非变性中间神经元。外侧杏仁核和梨形皮层的galanin免疫反应阳性的细胞,与NeuN共标,部分与Calbindin-D-28K共标,不与Calretinin、Parvalbumin、FJB共标,提示可能为Calbindin-D-28K阳性的非变性中间神经元。中缝背核galanin免疫反应阳性的细胞均与TPH共标,提示为5-HT能神经元。海马CA3区、梨形皮层、大脑皮层出现的异常的galanin免疫反应阳性的粗短的树突样染色,不与GFAP、CD11b、FJB共标,染色的性质还有待进一步研究。丘脑前背侧核内的galanin免疫反应阳性的细胞,与NeuN共标,不与Calbindin-D-28K、Calretinin、Parvalbumin、FJB共标,细胞的性质还有待进一步研究。
4、甘丙肽及其受体在颞叶癫痫病人标本中的变化
利用实时定量PCR技术,我们发现颞叶癫痫病人的颞叶标本与外伤术后非癫痫的颞叶标本相比,galanin、GalR1和GalR3的mRNA水平上调,结果与毛果芸香碱颞叶癫痫动物模型部分一致。
综上所述,以上数据表明甘丙肽及其受体参与了颞叶癫痫的发生与发展过程。本研究将为阐明颞叶癫痫的发病机制及寻找抗颞叶癫痫治疗的新靶点提供实验依据。